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醋酸甲羟孕酮体外诱导卵巢上皮癌SKOV-3细胞凋亡的研究

作　者: 李燕
导　师: 程文俊
学　校: 南京医科大学
专　业: 妇产科
关键词: MPA 卵巢上皮癌 PI3K/Akt信号转导通路 磷酸化 细胞凋亡
分类号: R737.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


卵巢上皮性癌是最常见的女性生殖系统肿瘤之一,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢癌的病理类型复杂,且具有易于转移和广泛播散的生物学行为,预后极差。近年来,大样本的流行病学研究和长期的临床实践均表明,孕激素可以拮抗雌激素的作用,保护卵巢,预防卵巢癌的发生。同时,有文献报道,孕激素可抑制卵巢癌细胞增殖,促进细胞凋亡,而其具体机制尚未可知。醋酸甲羟孕酮(Medroxyprogesterone Acetate, MPA)是一种孕激素类药物,可作为绝经期妇女激素替代疗法中孕激素的组分,也可用作避孕药物,或用来治疗子宫内膜异位症、痛经和闭经。由于MPA具有抗雌激素作用,并可作用于子宫内膜,促进子宫内膜由增生期向分泌期转变,因而已经被广泛用于雌孕激素受体阳性的子宫内膜癌的辅助治疗。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路作为细胞生存信号通路重要的调控位点,在细胞生存和凋亡调控过程中发挥重要作用。有研究显示,卵巢癌发病机制可能与PI3K/Akt表达或功能异常有关,大部分卵巢癌中都可出现Akt过表达现象。此外,PI3K/Akt信号转导通路是Bcl-2介导的细胞凋亡通路的上游调控程序之一,PI3K/Akt通路活化状态直接影响细胞的增殖和凋亡。因此,我们设想,MPA除可通过经典的孕激素受体途径外,是否还可以通过调节PI3K/Akt信号转导通路的活化状态影响卵巢上皮癌细胞的增殖和凋亡。虽然,目前已有的临床试验性治疗的结果显示,孕激素作为辅助药物治疗卵巢上皮性癌可获得良好的效果,但由于其作用机制尚不明确,故而是否可将孕激素作为辅助药物常规运用于卵巢癌的临床治疗目前还没有达成共识。本项研究尝试探索MPA体外诱导卵巢癌细胞凋亡可能存在的机制,为孕激素治疗卵巢癌提供新的理论依据。第一部分MPA体外诱导卵巢上皮癌SKOV-3细胞株凋亡目的:1.观察MPA在体外对孕激素核受体阴性的卵巢上皮性癌细胞株SKOV-3增殖的抑制作用。2.观察使用PI3K抑制剂LY294002作用后MPA对卵巢上皮性癌细胞株SKOV-3增殖抑制作用的变化。方法:1.卵巢上皮性癌SKOV-3细胞接种于盛有含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液的96孔板中常规培养至贴壁后,换无血清培养基继续培养24h,分别加入浓度为0.1、1、10、100μmol/L的MPA,分别作用12h、24h、48h后,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞相对活力。2.卵巢上皮性癌SKOV-3细胞株接种于盛有含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液的96孔板中常规培养至贴壁后,换无血清培养基继续培养24h,分别加入1、5、12.5、25μmol/L的LY294002(PI3K抑制剂)孵育1h后,再分别加入浓度为0.1、1、10、100μmol/L的MPA,药物作用12h、24h、48h后,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞相对活力。结果:1. MPA以时间-剂量依赖方式抑制SKOV-3细胞的体外增殖,药物作用时间越长、药物浓度越大,对细胞的毒性作用越明显(P<0.05)。2. MPA抑制SKOV-3细胞的体外增殖的作用可被LY294002所阻断。结论:1. MPA以时间-剂量依赖方式抑制SKOV-3细胞的体外增殖,这种抑制增殖的作用可被PI3K抑制剂LY294002所阻断。第二部分MPA可通过抑制PI3K/Akt信号转导通路活化诱导卵巢上皮癌SKOV-3细胞凋亡目的:1.研究PI3K/Akt信号转导通路在MPA诱导孕激素核受体阴性的SKOV-3细胞凋亡过程中发挥的作用。2.进一步探究非经典的孕激素受体在诱导卵巢上皮性癌细胞凋亡过程中可能存在的作用。方法:1.收集不同浓度MPA作用24h后的SKOV-3细胞,裂解细胞提取总蛋白,Western Blot法检测各细胞中Akt、磷酸化的Akt(phosphorylated Akt, p-Akt)、磷酸化的Bad (phosphorylated Bad, p-Bad)及Bcl-2蛋白表达水平。2.收集不同浓度MPA作用24h后的SKOV-3细胞,裂解细胞提取总蛋白,采用,冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶(Cysteine aspartic acid specific protease, Caspase)活力检测试剂盒检测细胞内Caspase-3和Caspase-8酶活力。3. SKOV-3细胞经不同浓度MPA作用12h后,Annexin V/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:1.随着MPA使用剂量的增大,SKOV-3细胞内p-Akt、p-Bad和Bcl-2蛋白表达水平逐步降低(P<0.05)。与对照组相比,当MPA浓度为0.1μmol/L时p-Akt表达降低约28%,p-Bad表达下降约48%,Bcl-2表达降低约10%,;当MPA浓度上升至100μmol/L时,p-Akt表达量降低约35%,p-Bad表达下降约76%,Bcl-2蛋白表达下降约43%。对照组及不同药物浓度实验组间Akt表达水平无明显变化(P>0.05)。2. MPA作用24h后,细胞内Caspase-3和Caspase-8酶活力明显升高(P<0.05)。当MPA浓度为0.1μmol/L时, Caspase-3和Caspase-8酶活力分别上升60.1%和47.1%;当MPA浓度上升至100μmol/L时,Caspase-3和Caspase-8酶活力分别上升82.6%和94.6%。3. MPA以剂量依赖方式诱导卵巢上皮癌SKOV-3细胞株凋亡(P<0.05)。孵育12h后,对照组细胞凋亡率为1.8%,低剂量MPA组(0.1μmol/L)细胞凋亡率上升至8.8%,当MPA浓度为100μmol/L时,细胞凋亡率上升至37.9%。结论:1. MPA通过非孕激素核受体依赖途径抑制PI3K/Akt信号转导通路的激活,降低细胞内游离的Bcl-2的水平,诱导SKOV-3细胞发生凋亡。2. MPA浓度为1μmol/L~10μmol/L,药物作用时间为12～24h时,细胞对药物最为敏感,抑制细胞增殖促进细胞凋亡的作用最强;再加大药物浓度或延长药物作用时间不能明显提高细胞的凋亡率。

全文目录


中文摘要  4-8
英文摘要  8-13
序言  13-18
第一部分 醋酸甲羟孕酮体外诱导卵巢上皮癌SKOV-3细胞株凋亡  18-24
  材料方法  18-22
  结果  22-24
第二部分 醋酸甲羟孕酮可通过抑制 PI3K/Akt信号转导通路诱导卵巢上皮癌SKOV-3细胞凋亡  24-34
  材料方法  24-31
  结果  31-34
讨论  34-38
结论  38-39
主要创新点  39-40
参考文献  40-50
文献综述  50-53
   参考文献  50-53
附录  53-56
  主要缩略词英中文对照  53-55
  攻读学位期间撰写及发表的文章情况  55-56
论著  56-80
致谢  80-81

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 卵巢肿瘤
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