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牛骨髓Cathelicidin类抗菌肽的克隆及表达

作　者: 徐鹏
导　师: 张勇
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 牛乳房炎 Cathelicidins抗菌肽 BMAP-28 Indolicidin 基因克隆原核表达抗菌活性
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

奶牛乳房炎是引起奶牛业损失较大的三大疾病之一,长期的抗生素治疗导致耐药菌的产生,使该病的防治更加困难。Cathelicidin类抗菌肽具有十分广泛的抗菌谱,在哺乳动物先天免疫上起重要的作用。近年来,伴随着分子生物学的发展,利用分子生物学技术开发新型抗菌肽药物,已成为预防和治疗乳房炎的一条新的途径。本研究以小牛的骨髓为材料,从骨髓组织中提取总RNA。利用RT-PCR技术扩增出Indolicidin和BMAP-28的基因片段,并将其克隆到pMD-18载体上,通过PCR、双酶切鉴定和测序分析三种方式鉴定,证实获得了重组克隆质粒pMD18-T-Indolicidin和pMD18-T-BMAP28。以重组质粒pMD18-T-BMAP28为模板扩增BMAP-28基因的去信号肽片段,连接到原核表达载体pET-28a,并转化到Rosetta宿主菌中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blot检测表达产物,回收目的蛋白。利用分离的某牛场乳房炎的主要致病菌和购买的标准菌检测了目的蛋白的抗菌活性。结果表明:1.克隆的Indolicidin基因序列与已发表的Indolicidin基因序列有1个碱基差异,但不影响氨基酸的序列。克隆的BMAP-28基因序列与已发表的BMAP-28基因序列有1个碱基差异,并导致氨基酸替换。2.经IPTG诱导后,含pET28a-BMAP28重组表达质粒的Rosetta菌能表达相对分子质量约为19.3kda的融合蛋白,与预期大小一致。3.分离的奶牛乳房炎的致病菌主要是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌,将其用于重组BMAP-28蛋白的抗菌性检测,重组BMAP-28蛋白对耐药性大肠杆菌、耐药性链球菌、大肠杆菌标准菌和金黄色葡萄球菌标准菌有明显的抑制作用,对耐药性金黄色葡萄球菌有微弱的抑制作用。

全文目录

摘要  4-5
Summary  5-7
缩略词表  7-11
第一章文献综述  11-25
  1 抗菌肽的研究进展  11-18
    1.1 抗菌肽概述  11-12
    1.2 抗菌肽的分类  12-13
      1.2.1 具有双亲螺旋结构的天蚕素类抗菌肽  12
      1.2.2 富含脯氨酸、甘氨酸的抗菌肽  12-13
      1.2.3 含二硫键的抗菌肽  13
      1.2.4 含特殊基团的抗菌肽  13
    1.3 抗菌肽的特性  13-14
    1.4 抗菌肽的作用机理  14-16
      1.4.1 抗菌肽的抗菌作用及其机理  14-15
      1.4.2 抗菌肽的抗病毒作用及其机理  15
      1.4.3 抗菌肽的抗寄生虫作用及其机理  15
      1.4.4 抗菌肽对肿瘤细胞作用及其机理  15-16
      1.4.5 抗菌肽的其他作用及其机理  16
    1.5 抗菌肽的应用前景  16-18
      1.5.1 替代传统治疗性抗生素  16-17
      1.5.2 治疗肿瘤疾病  17
      1.5.3 作为新型抗菌药物  17
      1.5.4 作为肉食品的保鲜剂  17
      1.5.5 作为饲料添加剂  17-18
      1.5.6 基因工程研究及应用  18
  2 牛骨髓 Cathelicdin 类抗菌肽的研究进展  18-22
    2.1 Cathelicdins 的基因组成及种类  18-19
      2.1.1 Cathelicdins 的基因组成  18-19
      2.1.2 哺乳动物内源性 Cathecilidins 的种类  19
    2.2 Cathelicdins 的表达分布  19-20
    2.3 Cathelicdins 的生物学活性  20-22
      2.3.1 抗菌作用  20-21
      2.3.2 促进创伤修复  21
      2.3.3 抑制组织损伤  21
      2.3.4 趋化作用  21
      2.3.5 刺激血管生成  21-22
      2.3.6 细胞溶解作用  22
    2.4 展望  22
  3 牛骨髓 Cathelicidin 类抗菌肽  22-25
    3.1 BMAPs  22-23
    3.2 Bac5、Bac7  23
    3.3 Indolicidin  23-24
    3.4 Dodecapeptide  24-25
第二章牛 Cathelicidin 类抗菌肽 Indolicidin 基因和 BMAP-28 基因的克隆  25-38
  1 前言  25
  2 实验材料与方法  25-34
    2.1 实验材料  25-27
      2.1.1 小牛骨髓、菌株和载体  25
      2.1.2 酶和试剂  25-26
      2.1.3 培养基  26
      2.1.4 溶液  26
      2.1.5 仪器与设备  26-27
    2.2 方法  27-34
      2.2.1 骨髓采集  27
      2.2.2 总 RNA 提取  27-28
      2.2.3 RT-PCR 扩增目的片段  28-30
      2.2.4 PCR 产物的回收与纯化  30
      2.2.5 目的基因的克隆  30-31
      2.2.6 转化菌的筛选与鉴定  31-34
  3 结果  34-37
    3.1 总 RNA 提取结果  34
    3.2 RT-PCR 扩增目的片段结果  34
    3.3 重组克隆质粒的 PCR、酶切鉴定结果  34
    3.4 重组克隆质粒的测序分析  34
    3.5 序列分析结果  34-37
  4 讨论  37-38
第三章牛 Cathelicidin 类抗菌肽 BMAP-28 基因的原核表达  38-49
  1 前言  38
  2 实验材料与方法  38-46
    2.1 实验材料  38-40
      2.1.1 菌株和载体  38
      2.1.2 酶和试剂  38
      2.1.3 培养基  38-39
      2.1.4 溶液  39
      2.1.5 仪器与设备  39-40
    2.2 方法  40-46
      2.2.1 重组表达载体的构建  40-42
      2.2.2 重组表达质粒的鉴定  42-43
      2.2.3 重组蛋白的诱导表达  43
      2.2.4 表达产物的检测  43-46
  3 结果  46-47
    3.1 重组表达载体的鉴定  46
    3.2 表达产物的 SDS-PAGE 电泳检测  46
    3.3 表达产物的 Western-blot 分析  46-47
  4 讨论  47-49
第四章乳房炎主要致病菌的分离及 BMAP-28 基因重组表达蛋白抑菌性的初步鉴定  49-59
  1 前言  49
  2 实验材料与方法  49-55
    2.1 试验材料  49-50
      2.1.1 乳房炎乳汁和诊断液  49
      2.1.2 菌种  49
      2.1.3 实验试剂  49-50
      2.1.4 溶液  50
      2.1.5 实验器材  50
    2.2 试验方法和步骤  50-55
      2.2.1 乳房炎的检查  50
      2.2.2 乳样的采集  50-51
      2.2.3 细菌的分离及培养特性鉴定  51-52
      2.2.4 细菌的形态学鉴定  52
      2.2.5 细菌的生化实验及鉴定  52-54
      2.2.6 BMAP-28 重组蛋白的浓度测定  54
      2.2.7 BMAP-28 重组蛋白的初步活性鉴定  54-55
  3 结果  55-57
    3.1 培养特性和形态学鉴定结果  55-56
    3.2 细菌分离鉴定结果  56
    3.3 G-250 染色法标准曲线  56
    3.4 药敏试验结果  56-57
  4 讨论  57-59
结论  59-60
致谢  60-61
参考文献  61-68
导师简介  68-69
个人简介  69-70

牛骨髓Cathelicidin类抗菌肽的克隆及表达

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