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奶牛乳房炎主要病原菌区系调查及金黄色葡萄球菌基因分型

作　者: 倪春霞
导　师: 胡永浩；蒲万霞
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌病原菌区系药敏试验基因分型 PCR
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

奶牛乳房炎是奶牛的一种常见病、多发病,主要由多种病原微生物感染引起。了解我国不同地区奶牛乳房炎主要病原菌种类、分布情况、药物敏感特性及其基因型,探讨不同菌株基因型与耐药性和致病性的关系,对奶牛乳房炎的防治具有重要意义。研究表明,金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要病原菌,其分离率在20%～80%之间,且金黄色葡萄球菌分布广泛,容易产生耐药性。因此,对金黄色葡萄球菌及其基因型、耐药性的研究,将为奶牛乳房炎的防治提供重要的技术资料。本试验对内蒙古、甘肃、上海、四川和贵州各地区的541份临床型、亚临床型乳房炎奶样进行主要病原菌区系调查和药敏试验。共分离到主要病原菌570株,细菌平均检出率为78.00%。其中内蒙古地区金黄色葡萄球菌36株(29.03%)、无乳链球菌36株(29.03%)、停乳链球菌24株(19.35%)、大肠杆菌16株(12.90%)、表皮葡萄球菌5株(4.03%)和乳房链球菌3株(2.42%),上海地区金黄色葡萄球菌66株(44.59%)、表皮葡萄球菌29株(19.59%)、无乳链球菌17株(11.49%)、停乳链球菌13株(8.78%)、乳房链球菌11株(7.43%)和大肠杆菌1株(0.67%),四川地区金黄色葡萄球菌20株(33.33%)、乳房链球菌13株(19.40%)、表皮葡萄球菌7株(10.45%)、停乳链球菌6株(8.99%)、大肠杆菌5株(7.46%)和无乳链球菌3株(4.48%),贵州地区金黄色葡萄球菌38株(43.18%)、停乳链球菌15株(17.05%)、表皮葡萄球菌12株(13.64%)、乳房链球菌5株(5.68%)和大肠杆菌2株(2.27%),甘肃地区表皮葡萄球菌50株(34.97%)、金黄色葡萄球菌27株(18.88%)、停乳链球菌17株(11.89%)、大肠杆菌11株(7.69%)、乳房链球菌8株(5.59%)和无乳链球菌4株(2.80%);金黄色葡萄球菌是不同地区奶牛乳房炎的优势致病菌。药敏试验表明,分离的主要病原菌对青霉素类、四环素类和糖肽类等药物产生不同程度的耐药性,对喹诺酮类和头孢菌素类药物显示出较好的抑菌作用。应用随机引物4M、OLP13和AP7对金黄色葡萄球菌标准菌株CVCC2246和分离自内蒙古、甘肃、四川、贵州和上海的176株金黄色葡萄球菌进行RAPD分型,利用BioNumerics软件对RAPD扩增产物进行聚类分析。结果表明,177株金黄色葡萄球菌RAPD扩增后,扩增条带在1～10条之间,所获条带分子量大小在250～4500bp之间;根据遗传距离的差异,引物OLP13将172株金黄色葡萄球菌分成了11个主要聚类群;引物4M将175株金黄色葡萄球菌分成了8个主要聚类群;引物AP7将174株金黄色葡萄球菌分成了12个主要聚类群。从分型率、扩增条带数目、扩增条带大小及范围来看,引物4M最好,OLP13次之,AP7较差;但从遗传聚类图及其区分系数来看OLP13最好。根据已发表的金黄色葡萄球菌的凝固酶基因序列设计引物,对上述177株金黄色葡萄球菌进行凝固酶基因分型,扩增分型结果显示共分为5个PCR型。其中以产物大小约900bp的PCR 2型为最多,占分离株的33.33%,经酶切后PCR 2型又分为两个不同的亚型,其它型的菌株酶切后条带无差异。根据已发表的金黄色葡萄球菌的16S rRNA基因序列和23S rRNA基因序列设计2对引物,进行金黄色葡萄球菌PCR检测试验,对176株阳性菌株和1株阴性对照菌株进行检测。建立了基于16S rRNA基因序列和23S rRNA基因序列的金黄色葡萄球菌PCR检测方法,与传统鉴定方法的相符率均为100%。

全文目录

中文摘要  2-4
Summary  4-6
缩略语  6-10
第一部分文献综述  10-26
  第一章奶牛乳房炎研究进展  10-14
    1 奶牛乳房炎及其危害  10
    2 奶牛乳房炎的流行情况  10-11
    3 奶牛乳房炎的发病原因  11
    4 奶牛乳房炎的防治  11-14
  第二章金黄色葡萄球菌分型研究进展  14-26
    1 分型的目的  14
    2 分型方法的评估  14-15
    3 分型方法  15-26
      3.1 金黄色葡萄球菌的表型分型  15-17
      3.2 金黄色葡萄球菌的基因分型  17-26
第二部分试验研究  26-61
  第三章奶牛乳房炎主要病原菌的分离、鉴定及药敏试验  26-40
    1 材料  26
      1.1 菌种  26
      1.2 奶样  26
      1.3 培养基  26
      1.4 药敏纸片  26
    2 方法  26-28
      2.1 乳样采集  26-27
      2.2 细菌分离培养  27
      2.3 生化鉴定  27
      2.4 药敏试验  27-28
    3 结果  28-37
      3.1 奶样中主要病原菌区系  28-30
      3.2 药物敏感试验结果  30-37
    4 讨论  37-38
      4.1 主要病原菌分离鉴定  37-38
      4.2 药物敏感性试验  38
    5 小结  38-40
  第四章基于16S RRNA 和23S RRNA 的金黄色葡萄球菌PCR 检测方法的建立  40-44
    1 材料  40-41
      1.1 菌种  40
      1.2 引物  40-41
      1.3 试剂  41
      1.4 仪器  41
    2 方法  41-42
      2.1 基因组DNA 的提取  41
      2.2 金黄色葡萄球菌16S RRNA 鉴定  41-42
      2.3 金黄色葡萄球菌23S rRNA 鉴定  42
    3 结果  42-43
      3.1 16S rRNA 鉴定  42
      3.2 23S rRNA 鉴定  42-43
    4 讨论  43
    5 小结  43-44
  第五章奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌随机扩增多态性分型  44-55
    1 材料  44-45
      1.1 基因组  44
      1.2 引物  44
      1.3 试剂  44-45
      1.4 仪器  45
    2 方法  45
      2.1 PCR 扩增  45
      2.2 RAPD 扩增产物电泳及图像聚类分析  45
    3 结果  45-48
      3.1 RAPD 分型电泳  45-48
      3.2 RAPD 分型电泳图像聚类分析  48
    4 讨论  48-51
    5 小结  51-55
  第六章奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌凝固酶基因分型  55-61
    1 材料  55-56
      1.1 基因组  55
      1.2 引物  55
      1.3 试剂  55
      1.4 仪器  55-56
    2 方法  56
      2.1 引物设计  56
      2.2 凝固酶基因扩增  56
      2.3 产物酶切反应  56
    3 结果  56-58
      3.1 凝固酶基因扩增  56-57
      3.2 P C R 产物酶切  57
      3.3 凝固酶基因多态性分型的区分系数  57-58
    4 讨论  58-59
    5 小结  59-61
参考文献  61-71
致谢  71-73
个人简介  73-74
导师简介  74-75

奶牛乳房炎主要病原菌区系调查及金黄色葡萄球菌基因分型

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