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云斑天牛触角全长cDNA文库的构建及化学感受蛋白基因的克隆

作　者: 葛红梅
导　师: 王满囷
学　校: 华中农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 云斑天牛触角 cDNA文库化学感受蛋白基因
分类号: S433
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

对昆虫嗅觉机理的深入研究和嗅觉信号传导途径的完整阐述,是探索害虫专一性防治的基础。云斑天牛Batocera horsfieldi（Hope）是我国一种主要的林木蛀干害虫,嗅觉在其交配、寻找食物和生存场所等行为过程中起着重要的作用,深入研究云斑天牛对环境化学因子刺激的感受机制及化学感受蛋白,将为云斑天牛可持续治理的提供新的策略。为此,本研究在利用SMART技术构建云斑天牛触角全长cDNA文库并结合批量EST测序及序列分析的基础上,运用RT-PCR方法克隆获得化学感受蛋白目的基因,并利用蛋白质凝胶电泳技术分析了云斑天牛化学感受蛋白在其机体中的分布。主要研究结果如下:1.用Creator^TM SMART^TM cDNA library construction kit构建了0.3-0.6kb和0.6-1kb两个特定片段大小的云斑天牛触角的全长cDNA文库,并对两个文库进行了质量鉴定。结果显示0.3-0.6kb云斑天牛触角全长cDNA文库的滴度为6.4×10⁵cfu/mL,库容量为8.9×10⁵克隆,插入片段大多在0.5-0.75kb之间,平均长度大于0.5 kb,重组率94.5%;0.6-1kb云斑天牛触角全长cDNA文库的滴度为4.1×10⁶cfu/mL,库容量为5.8×10⁶克隆,插入片段大多在0.75-1kb之间,平均长度大于0.7kb,重组率93.2%。文库质量鉴定结果表明,两个特定片段大小云斑天牛触角全长cDNA文库滴度、重组率符合文库质量要求。2.通过对两个云斑天牛触角的全长cDNA文库中随机挑取部分的单克隆测序,得到649条序列。用NCBI/GenBank/Blast、DNAMan和Vector NTI等进行序列分析,通过序列分析,获得了3个化学感受蛋白全长基因的序列。根据获得的一个化学感受蛋白全长基因设计特异引物,运用RT-PCR扩增得到393bp化学感受蛋白基因全长序列,推导出了131个氨基酸序列。从序列结构和生化特性来看,云斑天牛化学感受蛋白基因全长序列BhoCSP1具有昆虫化学感受蛋白典型的保守序列和结构域,即N端19个氨基酸的信号肽,序列中有4个保守的半胱氨酸位点。从同源性分析来看,云斑天牛化学感受蛋白基因全长序列BhoCSP1推导的氨基酸序列与目前报道鞘翅目唯一一种昆虫赤拟谷盗的19种化学感受蛋白的同源性较高,BhoCSP1与赤拟谷盗的TcaCSP10、TcaCSP12同源性分别为57%、59%。BhoCSP1推导的氨基酸序列与其它30种Endopterygota昆虫化学感受蛋白序列的同源性也较高,为21%-59%。从分析结果看,本研究所得到的393 bp的cDNA序列是编码云斑天牛化学感受蛋白BhoCSP1的核苷酸序列。3.雌性云斑天牛不同组织15%PAGE凝胶电泳结果表明,与头部、胸部、腹部相比,其触角和足中都含有化学感受蛋白BhoCSP1,且含量很高;雌云斑天牛触角还含有气味结合蛋白BhoOBP1、BhoOBP2。

云斑天牛触角全长cDNA文库的构建及化学感受蛋白基因的克隆

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