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基于桑树cDNA文库的3个功能基因的诱导表达研究

作　者: 扈东青
导　师: 赵卫国
学　校: 江苏科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: cDNA文库表达序列标签 MpsbR基因 M-PGIP基因 M-chitinase基因胁迫诱导表达桑树
分类号: S888.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

桑树是一种重要的经济作物,我国拥有世界上最为丰富的桑树种质资源。但是各种逆境条件和病虫害往往会对桑树的产量造成重大影响,研究桑树一些重要的功能基因及其在胁迫条件下的分子适应机制,可以增强桑树对各种胁迫条件的抗逆性,对桑树种质资源的保存和提高桑树产量有重要作用。与其他作物相比,我们对桑树功能基因的研究至今还处于起步阶段,对桑树的一些功能基因及其编码的蛋白质的功能仍然不甚了解。因此,开展桑树功能基因的研究是一项紧迫而有意义的工作。本文在构建的桑树幼叶cDNA文库的基础上获得了3个ESTs,克隆了这3个基因,并对获得的序列进行了分析和功能推断,用胁迫诱导的方法对这3个基因进行功能验证。本论文的主要研究内容如下:1、桑树几丁质酶基因M-chitinase的克隆及胁迫诱导表达分析从已构建的桑树幼叶cDNA文库得到了一个编码桑树几丁质酶(Chitinase)基因的一段序列,通过RACE与RT-PCR结合获得了这个基因的完整序列,命名为M-chitinase(GeneBank登录号:HQ117891)。序列分析表明,M-chitinase全长1392bp,存在60bp的5’端非翻译序列(5’-UTR)和255bp的3’端非翻译序列(3’-UTR),其开放读码框(ORF)长1077bp,编码358个氨基酸,预测蛋白质分子质量为38.52KD,等电点为4.466。同源分析表明,M-chitinase基因在桑树与卡西猪笼草、玉米、二倍体多年生大刍草等各物种间具有很高的保守性。基于桑树和其它19个物种M-chitinase基因的系统进化分析表明,桑树与野生烟草、湖南烤烟、辣椒、南芥的亲缘关系较近。半定量RT-PCR检测表明,幼叶表达量最高。与正常生长环境相比,M-chitinase基因mRNA的转录水平在NaCl、水杨酸、脱落酸条件下均有明显变化。2、桑树桑树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因M-PGIP的克隆,序列分析及诱导表达研究从已构建的桑树幼叶cDNA文库得到了一个编码桑树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(po1yga1acturonase inhibiting protein,PGIP)基因的一段序列,通过RACE与RT-PCR结合首次获得了这个基因的完整序列,命名为M-PGIP(GeneBank登录号:HM044383)。序列分析表明,M-PGIP全长1274bp,存在93bp的5’端非翻译序列(5’-UTR)和179bp的3’端非翻译序列(3’-UTR),其开放读码框(ORF)长1002bp,编码333个氨基酸,预测蛋白质分子质量为37.29KD,等电点为7.25。同源分析表明,M-PGIP基因在桑树与美洲李、桃花、梅花等各物种间具有很高的保守性。基于桑树和其它19个物种M-PGIP基因的系统进化分析表明,桑树与甜瓜、葡萄、葡萄根、猕猴桃的亲缘关系较近。半定量RT-PCR检测表明,幼叶表达量最高。与正常生长环境相比,M-PGIP基因mRNA的转录水平在水杨酸、脱落酸、盐胁迫条件下均有明显变化。并对所克隆的基因进行了原核表达,为今后的转基因植物抗病工程方面打下了良好的基础。3.桑树光合系统IIMpsbR基因的克隆,序列分析及诱导表达研究根据桑树表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs),采取RT-PCR方法克隆了一个编码桑树光合系统II PsbR基因的全长cDNA序列,命名为MpsbR(Genbank登录号:GU937873)。序列分析表明,该基因全长623bp,存在56bp的5’-UTR和306bp的3’-UTR,其开放阅读框(ORF)长261bp,编码86个氨基酸,预测蛋白质分子质量为8.95 kD,等电点为11.09。同源分析表明,桑树光合系统II MpsbR基因与花生、大豆编码氨基酸具有较高的同源性;根据MpsbR基因的氨基酸序列,与其它20个物种的氨基酸同源序列构建的系统进化树表明,桑树与花生、海桑、梨、大豆的亲缘关系较近。半定量RT-PCR研究表明,桑树光合系统MpsbR基因在桑树不同部位的表达水平有一定差异,在幼叶(刚展开第一张叶)和顶芽表达量最高,其作用机理有待于进一步研究之中。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-12
第1章绪论  12-18
  1.1 研究的目的与意义  12
  1.2 研究现状  12-17
    1.2.1 桑树几丁质酶基因的研究现状  12-15
    1.2.2 桑树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的研究现状  15-16
    1.2.3 桑树光合系统ⅡPsbR蛋白基因的研究现状  16-17
  1.3 研究内容  17-18
    1.3.1 桑树几丁质酶基因片段的克隆、序列分析和诱导表达  17
    1.3.2 桑树PGlP 蛋白基因片段的克隆、序列分析、诱导表达及在大肠杆菌中的表达  17
    1.3.3 桑树光合系统ⅡPsbR 蛋白基因的克隆，序列分析及表达  17-18
第2章桑树几丁质酶的克隆及胁迫诱导表达分析  18-28
  2.1 材料与方法  18-20
    2.1.1 植物材料和试剂  18
    2.1.2 实验方法  18-20
  2.2 结果与分析  20-27
    2.2.1 桑树M-chitinase基因的克隆  20-21
    2.2.2 桑树M-chitinase基因cDNA 全长的克隆  21-22
    2.2.3 桑树M-chitinase基因的全长cDNA序列分析  22-23
    2.2.4 桑树M-chitinase基因编码氨基酸的同源性与系统进化分析  23-25
    2.2.5 桑树M-chitinase基因各部位的表达分析  25-26
    2.2.6 桑树M-chitinase基因在胁迫条件下的表达分析  26-27
  2.3 结论和讨论  27-28
第3章桑树PGlP 蛋白基因片段的克隆、序列分析、诱导表达及在大肠杆菌中的表达  28-41
  3.1 材料与方法  28-30
    3.1.1 植物材料和试剂  28
    3.1.2 实验方法  28-30
  3.2 结果与分析  30-40
    3.2.1 桑树M-PGIP基因的克隆  30-31
    3.2.2 桑树M-PGIP基因cDNA 全长的克隆  31-32
    3.2.3 桑树M-PGIP基因的全长cDNA 序列分析  32-37
    3.2.4 桑树M-PGIP基因编码氨基酸的同源性与系统进化分析  37-38
    3.2.5 桑树M-PGIP基因在胁迫条件下的表达分析  38
    3.2.6 重组M-PGIP在大肠杆菌中的表达  38-40
  3.3 结论和讨论  40-41
第4章桑树光合系统ⅡMPsbR蛋白基因的克隆，序列分析及表达  41-49
  4.1 材料与方法  41-43
    4.1.1 材料及主要试剂  41
    4.1.2 实验方法  41-43
  4.2 结果与分析  43-47
    4.2.1 桑树光合系统Ⅱ MPsbR基因的克隆  43
    4.2.2 桑树光合系统Ⅱ MPsbR基因的全长cDNA序列分析  43-44
    4.2.3 桑树光合系统Ⅱ MPsbR基因编码氨基酸的同源性与系统进化分析  44-47
    4.2.4 桑树光合系统 ⅡMpsbR 基因在桑树不同部位的表达分析  47
  4.3 讨论  47-49
结论与展望  49-52
  5.1 结论  49-51
    5.1.1 桑树几丁质酶基因片段的克隆、序列分析和诱导表达  49
    5.1.2 桑树 PGlP蛋白基因片段的克隆、序列分析、诱导表达及在大肠杆菌中的表达  49-50
    5.1.3 桑树光合系统Ⅱ MPsb 基因的克隆和不同部位表达分析  50-51
  5.2 展望  51-52
参考文献  52-58
附录已登录GenBank序列号  58-59
攻读硕士学位期间发表的学位论文  59-60
致谢  60

基于桑树cDNA文库的3个功能基因的诱导表达研究

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