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根霉中β-葡萄糖苷酶基因克隆及表达

作　者: 丁丽霞
导　师: 汤斌
学　校: 安徽工程大学
专　业: 微生物
关键词: β-葡萄糖苷酶葡枝根霉TP-02 毕赤酵母 cDNA文库枯草芽孢杆菌克隆表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目前,地球上每年光合作用产生的纤维素类生物质资源,大部分都未被很好的开发与利用。对纤维素的开发利用仍然是一个世界性技术难题。用微生物生产纤维素酶降解纤维素来生产潜在的洁净的新能源乙醇,以解决能源紧缺的问题。纤维素酶是复合酶系,由外切葡聚糖苷酶酶、内切葡聚糖苷酶酶、β-葡萄糖苷酶组成,它们协同作用将纤维素降解成葡萄糖。在降解纤维素的过程中,由于β-葡萄糖苷酶的酶活较低、在三种酶的比例中β-葡萄糖苷酶所占的比例最低,抑制了纤维素酶的酶活。β-葡萄糖苷酶酶活低是提高纤维素酶酶活的瓶颈。本文在从黄山生态林腐木筛选出的具有较高纤维素酶活的葡枝根霉亚种点头根霉的基础上,构建β-葡萄糖苷酶基因工程菌,以期提高β-葡萄糖苷酶的酶活。主要研究成果如下：构建了葡枝根霉的cDNA表达文库,采用水解七叶苷产生黑色的水解圈的方法,从cDNA文库中筛选重组子,成功的从文库中分离出产β-葡萄糖苷酶的重组菌株。对产β-葡萄糖苷酶的阳性克隆测序,经在NCBI上比对分析,发现为两条新的β-葡萄糖苷酶编码基因,上传至GenBank,并获得登录号为：HQ222598、HQ222599;重组蛋白的分子量分别为46kD and 47kD。在MM培养基中发酵96 h,在1%的甲醇诱导的条件下,重组毕赤酵母产生的葡萄糖苷酶酶活分别达到8.2 IU/mL和9.9 IU/mL。分别较原菌株葡枝根霉的β-葡萄糖苷酶酶活提高了1倍和1.41倍。根据从葡枝根霉cDNA文库中分离出具有能够表达较高β-葡萄糖苷酶酶活的bgl1基因设计了引物P1：5’-GCGAAGCTTATGTGTCCCGAGGACTAT-3’(其中划线部分为EcoR I酶切位点),引物P2:5’-TAGAATTCTCACGC CGCCTCAA TCCA G-3’(其中划线部分为HindⅢ酶切位点)以从GS115/pPIC9K-bgl1的重组质粒为模板,PCR扩增出了bgl1基因,与双酶切后的pMA5链接,并且成功的转化到了枯草芽孢杆菌WB600中优化了重组枯草芽孢杆菌的发酵条件,确定了发酵培养基中碳源纤维二糖最适浓度浓度为0.8%,最佳氮源是有机氮源蛋白胨,其最适浓度为1.5%,磷酸氢二钾的最适浓度为1%。在最终的培养基中,重组菌WB600/pMA5-bgl1在34 h时发酵产酶的β-葡萄糖苷酶酶活最高,达到18.05 IU/mL。最适培养基成分为：0.8%纤维二糖、1.5%蛋白胨、1%磷酸氢二钾、0.07%硫酸镁、0.1%的酵母粉、0.5%氯化钠、40ug/ml氨苄。

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摘要 5-7ABSTRACT 7-10目录 10-14绪论 14-22 1.1 选题意义 14 1.2 β-葡萄糖苷酶来源及分类 14-16 1.2.1 β-葡萄糖苷酶来源 14-15 1.2.2 β-葡萄糖苷酶分类 15-16 1.3 β-葡萄糖苷酶的结构及催化机理 16-17 1.3.1 β-葡萄糖苷酶的分子量大小 16 1.3.2 β-葡萄糖苷酶的结构 16-17 1.3.3 β-葡萄糖苷酶作用机理 17 1.4 β-葡萄糖苷酶基因克隆表达的国内外研究进展 17-19 1.4.1 β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达 17-18 1.4.2 β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的表达 18 1.4.3 β-葡萄糖苷酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达 18-19 1.5 β-葡萄糖苷酶的应用及前景展望 19-21 1.5.1 β-葡萄糖苷酶在医学领域 19 1.5.2 低聚龙胆糖生产 19 1.5.3 水解纤维素 19-20 1.5.4 作为风味酶 20 1.5.5 在其它应用 20-21 1.6 本研究的目的和内容 21-22 1.6.1 研究目的 21 1.6.2 研究内容 21-22第二章葡枝根霉cDNA文库的构建及β-葡萄糖苷酶基因的分离 22-46 2.1 实验材料 22-25 2.1.1 菌种及载体 22 2.1.2 培养基 22-23 2.1.3 主要试剂 23 2.1.4 器材与仪器 23-25 2.2 实验方法 25-33 2.2.1 菌丝体预处理 25 2.2.2 mRNA提取及纯度鉴定 25-26 2.2.3 cDNA双链全长合成 26-27 2.2.4 接头连接 27-28 2.2.5 NotⅠ酶切 28 2.2.6 去除短链cDNA 28-29 2.2.7 pPIC9K原核宿主菌的培养及质粒pPIC9K提取 29-30 2.2.8 质粒双酶切 30 2.2.9 表达质粒pPIC9K-cDNA的构建 30-31 2.2.10 毕赤酵母GS115感受态制备 31 2.2.11 转化毕赤酵母GS115 31-32 2.2.12 阳性克隆的筛选及序列分析 32 2.2.13 发酵性能的测定 32-33 2.2.14 发酵液纯化及SDS-PAGE 33 2.3 实验结果 33-41 2.3.1 pPI9K质粒的提取 33-35 2.3.2 阳性克隆的筛选 35 2.3.3 测序及序列分析 35-37 2.3.4 SDS-PAGE电泳 37-38 2.3.5 葡萄糖标准曲线的绘制 38-40 2.3.6 β-葡萄糖苷酶酶活测定 40-41 2.4 讨论 41-46 2.4.1 小结 41 2.4.2 表达重组β-葡萄糖苷酶的Pichia pastoris表达系统评析 41-46第三章 bgl1在枯草芽孢杆菌中的克隆及表达 46-58 3.1 实验材料 46-47 3.1.1 菌种及载体 46 3.1.2 培养基 46 3.1.3 主要试剂 46-47 3.1.4 器材与仪器 47 3.2 实验方法 47-50 3.2.1 Bgl1基因克隆 47-48 3.2.2 DNA的回收、纯化 48-49 3.2.3 对目的基因和质粒酶切 49 3.2.4 重组质粒bgl1-pMA5的构建 49 3.2.5 WB600感受态的制备 49-50 3.2.6 重组质粒转化 50 3.2.7 阳性重组子的酶切验证 50 3.2.8 重组菌WB600/pMA5-bgl1发酵性能 50 3.3 实验结果 50-57 3.3.1 bgl1基因克隆 50-51 3.3.2 双酶切验证 51-52 3.3.3 重组菌WB600/pMA5-bgl1发酵性能 52-57 3.3.3.1 重组菌WB600/pMA5-bgl1发酵条件的优化 52-57 3.3.3.1.1 纤维二糖浓度对重组菌WB600/pMA5-bgl1发酵的影响 52-53 3.3.3.1.2 氮源对重组菌WB600/pMA5-bgl1发酵的影响 53-55 3.3.3.1.3 无机盐对重组菌WB600/pMA5-bgl1发酵的影响 55-57 3.4 讨论 57-58 3.4.1 小结 57 3.4.2 对枯草芽孢杆菌表达系统发酵的评价 57-58第四章结论与展望 58-60 结论 58 展望 58-60参考文献 60-69本人在攻读硕士学位期间发表的学术论文 69-70致谢 70

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