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云斑天牛交配行为研究及化学感受蛋白基因的克隆

作　者: 罗森林
导　师: 王满囷
学　校: 华中农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 云斑天牛 交配行为 交配和产卵节律 配偶定位和识别 化学感受蛋白基因
分类号: S763.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


云斑天牛Batocera horsfieldi (Hope),属于鞘翅目Coleoptera,天牛科Cerambycidae,是用材林、防护林和经济林的一种重要的毁灭性蛀干害虫。由于其幼虫生活习性隐蔽,防治十分困难。随着化学生态学的发展,基于有取食和交配等裸露活动的成虫期防治策略已经成为探索云斑天牛防治的新途径。但目前关于云斑天牛的交配行为及其交配行为所利用的信号还未见报道。为此,本研究在对云斑天牛交配行为观察的基础上,分析了嗅觉及视觉在其交配过程中的功能,并克隆了其化学感受蛋白基因,以期为阐明云斑天牛的交配行为机制及开发新的防治方法提供理论基础和技术支持。主要研究结果如下：1.云斑天牛的交配行为在室内对60对云斑天牛交配行为的观察发现,雄虫有80%是在没有触角接触的情况下与雌虫完成相遇进而抱对的,即雄虫主要不通过触角接触这种方式寻找雌虫；云斑天牛一次完整的交配行为分为三个阶段：相遇抱对、尝试交配和输精、配后保护。从抱对到雄虫输精之前的阶段,统称为尝试交配阶段,该阶段平均需时32.7min,在这期间雄虫有不断舔触雌虫鞘翅的行为；从雄虫开始输精到输精完成平均时间61.2s；88.3%的云斑天牛输精完成后仍然保持着抱对状态即为配后保护阶段,平均用时25.5min。在室内对云斑天牛整个成虫期交配和产卵行为进行了观察。结果表明平均每对云斑天牛交配26.2次；交配次数第一次高峰出现在羽化出孔后的7d-8d,总的趋势是随着日龄增加交配次数减少；在一天中,交配主要发生在12：00-22：00,特别是16：00-18：00。雌虫从羽化出孔12日后产卵,产卵过程大致持续30min,平均每雌产卵39.8粒,产卵数随着日龄增加而增加,在36日龄产卵量达到峰值,之后减少进入生殖末期。2.云斑天牛配偶定位和识别在室内利用“Y”型嗅觉仪测试了云斑天牛雌、雄成虫之间的嗅觉反应。结果表明,以空气为对照时,雌虫对雄虫有明显的吸引作用(P<0.05),而雄虫对雌虫则无明显的吸引作用(P>0.05)；当以补充营养植物野蔷薇为对照时,雄虫对雌虫+野蔷薇、雌虫对雄虫+野蔷薇均无明显的行为趋向(P>0.05)。说明雌虫可能存在非接触性信息素,而雄虫则可能不存在非接触性信息素。冻死雌虫与活雌虫同样能够引起测试雄虫曲腹的交配反应,但经正己烷浸泡后的雌虫则不会引起雄虫曲腹行为；而将雌虫正己烷浸泡液回滴到正己烷浸泡后的雌虫或雄虫、以及玻璃管上时,均能够引起雄虫的曲腹行为。说明云斑天牛雌虫存在接触性信息素,雄虫通过接触性信息素对雌虫进行识别。利用气相色谱—质谱联用技术(GC-MS)对云斑天牛雌、雄成虫正己烷提取物进行了分离鉴定。在本试验条件下,云斑天牛雌、雄成虫正己烷提取物共分离鉴定出32种化合物,雌虫28种、雄虫24种；其中有8种化合物是雌虫所特有的,而对于哪种或哪些化合物对雄虫具有行为活性还需要进一步研究。3.云斑天牛化学感受蛋白基因的克隆和序列分析云斑天牛雄虫下颚须的舔翅行为在配偶识别方面有重要作用。为了明确其化学感受机制,利用RT-PCR技术克隆获得了云斑天牛下颚须中的化学感受蛋白基因(BhorCSP2),其核苷酸序列可读框全长384bp,编码127个氨基酸残基；推导的氨基酸序列分析表明其有保守的4个半胱氨酸位点和19个氨基酸的信号肽序列,具有昆虫化学感受蛋白的典型特征；通过对BhorCSP2编码的氨基酸和其它昆虫的30种CSP编码的氨基酸进行进化分析,发现该基因与赤拟谷盗TcasCSP11的同源性最高。

全文目录


摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
第一章 文献综述  13-24
  1 云斑天牛的研究现状  13-15
    1.1 云斑天牛的为害概况  13
    1.2 云斑天牛的生物学特性  13
    1.3 云斑天牛对寄主的选择  13-14
    1.4 云斑天牛的防治  14-15
  2 天牛成虫行为的研究  15-18
    2.1 天牛的扩散与取食行为  15-16
    2.2 天牛的交配行为及策略  16-17
      2.2.1 天牛的交配行为  16-17
      2.2.2 天牛的多次交配与精子竞争  17
    2.3 天牛的产卵行为  17-18
  3 天牛化学生态学的研究  18-21
    3.1 天牛性信息素  18-19
      3.1.1 已知存在性信息素的天牛  18-19
      3.1.2 性信息素的类型  19
      3.1.3 性信息素的化学组分  19
    3.2 天牛的寄主信息物质  19-20
      3.2.1 寄主信息物质的种类  19-20
      3.2.2 寄主信息物质对天牛行为的影响  20
    3.3 天牛的感器  20-21
  4 昆虫化学感受蛋白的研究  21-22
    4.1 气味结合蛋白(OBPs)  21-22
    4.2 化学感受蛋白(CSPs)  22
      4.2.1 CSPs的特性及分布部位  22
      4.2.2 CSPs的生理功能  22
  5 结语  22
  6 课题研究的目的与意义  22-24
第二章 云斑天牛的交配行为  24-38
  第一节 云斑天牛交配行为的观察  24-32
    1 材料和方法  24-25
      1.1 供试昆虫  24
      1.2 实验方法  24-25
    2 结果与分析  25-30
      2.1 相遇抱对  27
      2.2 尝试交配和输精  27-29
      2.3 配后保护  29-30
    3 讨论  30-32
  第二节 云斑天牛交配、产卵节律的初步研究  32-38
    1 材料和方法  32-33
      1.1 供试昆虫  32
      1.2 实验方法  32-33
      1.3 数据处理和分析  33
    2 结果与分析  33-37
      2.1 云斑天牛雌虫的产卵行为  33-34
      2.2 云斑天牛交配行为的日龄节律  34-35
      2.3 云斑天牛交配行为的昼夜节律  35-36
      2.4 云斑天牛产卵行为的日龄节律  36-37
    3 讨论  37-38
第三章 云斑天牛的配偶定位和识别  38-57
  第一节 云斑天牛的配偶定位机制  38-47
    1 材料和方法  38-41
      1.1 供试昆虫  38
      1.2 实验仪器  38-39
        1.2.1 Y型嗅觉仪  38-39
        1.2.2 风洞  39
      1.3 实验方法  39-41
        1.3.1 Y型嗅觉仪实验  39-40
        1.3.2 风洞实验  40-41
      1.4 数据处理与分析  41
    2 结果与分析  41-44
      2.1 Y型嗅觉仪实验  41-43
      2.2 风洞实验  43-44
    3 讨论  44-47
  第二节 云斑天牛雌虫接触性信息素的证实  47-52
    1 材料和方法  47-48
      1.1 供试昆虫  47
      1.2 实验方法  47-48
        1.2.1 云斑天牛雌虫接触性信息素回滴实验  47-48
        1.2.2 回滴玻璃管模拟实验  48
    2 结果与分析  48-50
      2.1 云斑天牛雌虫接触性信息素回滴实验  48-50
      2.2 回滴玻璃管模拟实验  50
    3 讨论  50-52
  第三节 云斑天牛接触性信息素的分离和鉴定  52-57
    1 材料和方法  52-53
      1.1 分析样品及处理方法  52
      1.2 实验仪器  52
      1.3 实验方法  52-53
        1.3.1 云斑天牛接触性信息素的分析条件  52-53
        1.3.2 云斑天牛接触性信息素成分的鉴定与定量  53
    2 结果与分析  53-55
    3 讨论  55-57
第四章 云斑天牛化学感受蛋白基因的克隆  57-69
  1 材料和方法  57-61
    1.1 供试昆虫  57
    1.2 主要试剂和溶液  57-58
      1.2.1 主要试剂盒  57-58
      1.2.2 LB培养基的配制  58
    1.3 实验方法  58-61
      1.3.1 文库序列分析和特异性引物设计  58
      1.3.2 云斑天牛下颚须总RNA的提取  58-59
      1.3.3 反转录合成cDNA第一链  59
      1.3.4 PCR扩增反应体系  59-60
      1.3.5 PCR产物的回收  60
      1.3.6 胶回收片段与载体pGEM-T载体连接  60-61
      1.3.7 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备  61
      1.3.8 连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞  61
      1.3.9 克隆基因的序列测定和序列分析  61
  2 结果与分析  61-68
    2.1 云斑天牛总RNA的提取  61-62
    2.2 云斑天牛化学感受蛋白基因RT-PCR扩增产物  62
    2.3 阳性克隆PCR扩增检测结果  62-63
    2.4 云斑天牛化学感受蛋白基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列  63-64
    2.5 云斑天牛BhorCSP2与其它昆虫CSP同源性分析  64-68
  3 讨论  68-69
第五章 结论与展望  69-71
  1 结论  69-70
    1.1 云斑天牛交配行为及交配、产卵行为节律  69
    1.2 云斑天牛的配偶定位和识别机制  69
    1.3 云斑天牛下颚须中化学感受蛋白基因(CSP)的克隆  69-70
  2 展望  70-71
参考文献(REFERENCE)  71-79
研究生期间发表和投稿的论文  79-80
致谢  80

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林保护学 > 森林病虫害及其防治 > 虫害及其防治
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