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若干大黄鱼性腺发育相关基因的克隆与表达

作　者: 周鹏
导　师: 王艺磊
学　校: 集美大学
专　业: 水产养殖
关键词: 大黄鱼 EST 线性化cDNA文库 性腺发育相关基因 qRT-PCR RACE
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 52次
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内容摘要


以大黄鱼(Larimichthys crocea)性腺为材料,采用SMART(switching mechanism at 5’end of RNA transcript)技术和DSN (duplex-specific nuclease)处理构建了大黄鱼性腺线性化cDNA文库,并从文库中随机挑取了3961个克隆进行测序,共获得3535条高质量的表达序列标签(Expressed Sequence Tag, EST)。序列经聚类分析后共得到2916条Unigene,包括415条contigs和2501条singletons。初步分析结果表明：该线性化文库的库容为4.3×106pfu/mL,文库重组率达95.8%,EST的非冗余率为82.49%, Unigene的平均长度为355 bp。经生物信息学分析,1785个为已知基因占总ESTs的61.21%；其中与性腺发育相关的基因66个,占已知基因的3.70%。微卫星分析发现共有129条EST序列含有149个微卫星重复序列,包括6条与性腺发育相关的ESTs。利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术分析了11个与性腺发育相关基因在大黄鱼性腺的表达情况。结果显示精巢特异性LRR基因(testis-specific LRR)只在大黄鱼精巢中表达(P<0.05)；雄性特异性致死3样1基因(MSL3L1),雄激素相互作用受体核蛋白激酶基因(ARINPK),精子发生凋亡相关蛋白基因(SARP),热休克蛋白70(HSP70)和细胞周期蛋白A1基因(cyclin A1)在精巢中的表达量高于卵巢(P<0.05)；相反,组织蛋白酶C基因(Cathepsin C),核自身抗原精蛋白基因(NASP)和细胞周期蛋白B1 (cycli B1)在卵巢中的表达量高于精巢(P<0.05)；促分裂原激活蛋白激酶1(MAPK1)和泛素C末端水解酶L5 (UCH-L5)在精巢和卵巢中表达没有显著差异(P>0.05)。在上述结果的基础上,利用SMART-RACE技术或RT-PCR技术克隆了大黄鱼性腺发育相关基因cyp19a、cyp19b、cyclin B1、CDC2、UBE2D和UBC9全长cDNA序列,其长度分别为1805 bp、2268 bp、1882 bp、1151 bp、798 bp和846 bp,可分别编码518、500、397、303、147和148个氨基酸的前体蛋白。利用qRT-PCR技术分析这些基因在大黄鱼各器官的表达情况,结果显示：cyp19a在卵巢中的表达量显著高于精巢(P<0.01),且cyp19a在精巢和卵巢中的表达均极显著高于其它各器官(P<0.01); cyp19b在端脑、中脑、下丘脑、脾和肝有较高表达量,在雄性大黄鱼的血中表达量最高。在性腺表达量极低。cyclin B1和CDC2基因在性腺中的表达量极显著高于其它各器官(P<0.01),且在卵巢中的表达量较精巢高(P<0.05)。UBE2D在脾脏和性腺中表达量较高,其它器官表达量较低,在性腺中的表达极显著高于其它各器官(除脾脏外)(P<0.01)。UBC9在性腺中表达量较高,且极显著高于其它各器官(P<0.01)。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章 引言  9-15
  1.1 本研究的目的与意义  9
  1.2 均一化全长cDNA文库构建的意义  9-10
  1.3 表达序列标签的概述  10-11
  1.4 鱼类性腺发育相关基因的研究进展  11-14
  1.5 本研究的技术路线  14-15
第二章 大黄鱼性腺线性化cDNA文库构建及ESTs分析  15-37
  2.1 材料与方法  15-21
    2.1.1 材料  15-16
    2.1.2 方法  16-21
  2.2 结果  21-31
    2.2.1 大黄鱼性腺总RNA的抽提和mRNA的分离纯化  21
    2.2.2 cDNA文库构建和质量检测  21-22
    2.2.3 ESTs聚类和微卫星分析  22-25
    2.2.4 ESTs同源分析和注释  25-31
    2.2.5 部分性腺发育相关基因在性腺的表达分析  31
  2.3 讨论  31-37
    2.3.1 线性化文库构建效率  31-33
    2.3.2 含微卫星序列的EST序列分析  33-34
    2.3.3 性腺发育相关基因及表达分析  34-37
第三章 大黄鱼性腺发育相关基因克隆及器官表达  37-75
  3.1 材料与方法  37
    3.1.1 材料  37
  3.2 方法  37-41
    3.2.1 各器官RNA的提取  37
    3.2.2 SMART-RACE技术获取基因全长  37-40
    3.2.3 合成RT-PCR cDNA第一链和PCR扩增  40
    3.2.4 割胶纯化基因片段  40
    3.2.5 与质粒载体连接  40
    3.2.6 连接产物转化  40-41
    3.2.7 质粒插入片段的检测  41
    3.2.8 质粒测序及测序结果拼接  41
    3.2.9 目的基因的生物信息学分析  41
    3.2.10 荧光定量PCR分析各基因在各器官的表达  41
  3.3 结果  41-75
    3.3.1 总RNA的抽提结果  41
    3.3.2 RACE-PCR扩增结果  41-42
    3.3.3 RT-PCR扩增结果  42-43
    3.3.4 Cyp19a基因序列分析及在各器官中的表达  43-49
    3.3.5 Cyp19b基因序列分析及在各器官中的表达  49-55
    3.3.6 Cyp19b基因序列分析及在各器官中的表达  55-60
    3.3.7 CDC2基因序列分析及在各器官中的表达  60-64
    3.3.8 UBE2D基因序列分析及在各器官中的表达  64-66
    3.3.9 UBC9基因序列分析及在各器官中的表达  66-70
    3.3.10 讨论  70-75
第四章 结论与展望  75-76
致谢  76-78
参考文献  78-90
在学期间发表的学术论文和研究成果  90

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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