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18日龄日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库的构建及抱雌沟蛋白相互作用因子的筛选

作　者: 李勉
导　师: 张龙现；金亚美
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 日本血吸虫酵母双杂交 cDNA文库抱雌沟蛋白筛选
分类号: S852.735
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

日本血吸虫病(Schistosomiasis japonica)是我国一种危害严重的人畜共患寄生虫病。在我国流行的血吸虫病主要是由日本血吸虫病中国大陆株引起。发育成熟的雌虫产生的大量虫卵是引起日本血吸虫病很多病理变化的主要原因,另外,排出的虫卵也是该病发生的传染源。如果将已配对的雌虫和雄虫分离,则雌虫将停止产卵并且退化至一种未发育完全的状态,如果重新将其进行配对,则其仍能够继续发育成熟。抱雌沟蛋白(SjGCP:Schistosoma japonicum gynaecophoral canal protein)存在于成虫表面尤其是雄虫表面且只局限于在配对的直接作用部位-抱雌沟进行表达。有趣的是,抱雌沟蛋白的转录表达在雌雄虫配对的同时达到高峰。这表明,抱雌沟蛋白在雌雄虫的相互作用和刺激雌虫发育成熟中发挥着潜在的作用。因此,对抱雌沟蛋白的深入研究对揭露血吸虫成熟的作用机理显得格外重要。基于这个目的,我们构建了18日龄日本血吸虫酵母双杂交 cDNA文库并且用抱雌沟蛋白进行初步筛选。18日龄日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库的构建：选取日本血吸虫18日龄虫体,用Trizol法提取虫体总RNA,以Oligo(dT)为引物反转录合成一链cDNA,再以5′amplimer和3′amplimer为引物进行LD-PCR扩增,从而得到双链cDNA.将双链cDNA用CHROMA SPINTE-400柱纯化后,用酵母杂交(Yeast mating)方法将其与PGADT7-Rec转化至感受态酵母细胞AH109,二者在酵母细胞中同源组成环形的有复制活性的cDNA文库质粒,收集缺亮氨酸(SD/-Leu)培养板上所有克隆,即为18日龄日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库菌。转化子细胞密度大于2×107cells/mL,库容量为2.5×106 pfu/mL,插入的双链cDNA片段的长度在0.25～2.0kb之间,文库重组比率为99%,该文库具有良好的代表性。6对特异性引物均能从文库中钓取到日本血吸虫成虫相关基因。本试验利用酵母双杂交技术成功构建了日本血吸虫18日龄成虫的cDNA文库。应用于酵母双杂交系统的抱雌沟蛋白融合质粒的构建和验证：将编码抱雌沟蛋白的基因的完整的开放阅读框作为靶蛋白基因克隆至pGBKT7质粒去构建重组载体pGBKT7-SjGCP,将pGBKT7-SjGCP转至酵母Y187株的感受态细胞内。自转录活性检测、蛋白表达和毒性检测结果显示SjGCP靶蛋白适用于酵母双杂交系统。抱雌沟蛋白相互作用因子的筛选：用酵母杂交(Yeast Mating)的方法对日本血吸虫18日龄酵母双杂交cDNA文库进行筛选,对所长出的阳性克隆(蓝斑)用反复传代的方法进行筛选,我们得到了330个克隆。对随机挑选出来的5个克隆提取酵母质粒,并用电转化的方法将其分别转至大肠杆菌DH5a株后进行测序分析。我们得到了5个日本血吸虫的EST序列：SJCHGC0566829、SJCHGC09129、SJCHGC 00694、SJCHGC0607和SJCHGC05265,其分别表达日本血吸虫的twinfilin蛋白基因、collagen蛋白基因、HSP60蛋白基因和未知基因。从已拿到序列的5个克隆中随机挑选出3个克隆利用共转化的方法分析其在酵母中的相互作用。

全文目录

致谢  4-6
中文摘要  6-8
文献综述  8-20
第一部分 18日龄日本血吸虫酵母双杂交 cDNA文库的构建  20-32
  1 材料与方法  20-27
  2 结果与分析  27-30
  3 结论与讨论  30-32
第二部分 PGBKT7-SjGCP融合载体的构建及鉴定  32-38
  1 材料和方法  32-36
  2 结果  36-37
  3 讨论  37-38
第三部分应用酵母双杂交技术筛选与抱雌沟蛋白相互作用的因子  38-49
  1 材料与方法  38-42
  2 结果与分析  42-48
  3 讨论  48-49
参考文献  49-53
英文摘要  53-55
个人简历  55

18日龄日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库的构建及抱雌沟蛋白相互作用因子的筛选

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