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甲状旁腺激素羧基端肽段细胞凋亡作用的研究

作　者: 张莹
导　师: 张镜宇
学　校: 天津医科大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 甲状旁腺激素羧基端肽段甲状旁腺激素羧基端肽段受体细胞凋亡成骨细胞
分类号: R341
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

甲状旁腺素（PTH）是由甲状旁腺主细胞合成分泌的、调节钙磷代谢及骨转换的重要肽类激素。人体血液循环中存在三种PTH分子：PTH1-84、PTH37-84及少量PTH7-84,后两者称为PTH羧基端肽段（C-PTH）。研究发现,PTH1-34具有与PTH1-84完全相同的受体结合能力及促成骨作用,美国FDA已于2001年批准甲状旁腺素（1-34）肽（rhPTH1-34）用于治疗妇女绝经后骨质疏松症。但实验发现,当给予大鼠PTH1-34后骨肉瘤的发病率明显上升（最高致瘤率达52%）。近来发现,人体内存在C-PTH受体（CPTHR）, C-PTH与其特异性受体（非PTH受体）结合后可产生促细胞凋亡的生物学效应。因此我们推断PTH1-34的成骨-即抗成骨细胞凋亡作用可能诱发成瘤,而C-PTH的促凋亡作用可抑制PTH1-34的成瘤效应。该推断如果成立,将会对PTH在调节骨代谢方面作用的研究产生极其深远的影响。目的本研究拟从细胞实验和动物实验两方面,采用real-time PCR、western blot等实验技术和方法探讨PTH1-84、PTH37-84及PTH1₃4对细胞周期的作用。已期阐明不同PTH分子对成骨细胞凋亡的不同作用,特别是人体内所含有的C-PTH分子即PTH37-84对成骨细胞细胞周期及细胞凋亡的影响,从而进一步证明C-PTH有促凋亡的作用,可能与抑制肿瘤的发生有关。方法1.培养原代成骨细胞：2日龄大鼠,采用酶交替消化法对成骨细胞进行分离。ALP染色、Von Kossa染色进行鉴定。2.进行药物干预：加入10"9 mol/L的PTH1-34,PTH37-84,PTH1-84,对照组加入等体积的PBS,培养24h后,收获细胞,分别提取总RNA和蛋白质。3.采用real-time PCR技术,2-ΔΔCT法在mRNA水平检测骨肉瘤相关凋亡基因：bax、bcl-2、caspase3、c-fos、cyclin Dl,并检测管家基因GAPDH作为内参照。SPSS 14.0统计软件处理试验数据,多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用Student-Newman-Keuls检验。4.采用western blot技术,在蛋白质水平检测骨肉瘤相关凋亡蛋白（检测对象同上）,并检测管家基因GAPDH作为内参照。将曝光后X-ray照片用UVP凝胶成像分析系统进行扫描,计算各基因蛋白条带与内参GAPDH蛋白条带的光密度比值,推算各凋亡因子表达的变化趋势。5.构建动物模型：对于联合切除甲状腺及甲状旁腺的大鼠随机分成4组,分别给予40μg/Kg的PTH1-34、PTH37-84、PTH1-84及生理盐水,给药持续2个月,取骨组织分别提取总RNA和蛋白质。6.采用real-time PCR、western blot技术检测骨肉瘤相关凋亡基因在mRNA水平及蛋白质水平的表达。（同细胞实验部分）结果1.细胞实验部分：（1）原代成骨细胞的鉴定：原代成骨细胞经传代后,于显微镜下观察,细胞贴壁生长,形态以不规则形、长梭形、三角形为主,经ALP染色,说明细胞纯度较高。并采用Von Kossa染色,镜下见黑色的矿化结节,说明本实验分离得原代成骨细胞具有矿化功能。（2）PTH1-34对原代成骨细胞的作用：实验结果显示,给予10-9 mol/L的PTH1-34的原代成骨细胞,抑制细胞凋亡的基因（如bcl-2, caspase3, c-fos, cyclin Dl）与对照组相比,表达量明显增加；促进细胞凋亡的基因（如bax）与对照组相比,表达量明显降低。mRNA水平与蛋白质水平结果一致。（3）PTH37-84对原代成骨细胞的作用：实验结果显示,给予10"9 mol/L的PTH37-84的原代成骨细胞,促进细胞凋亡的基因（如bax）与对照组相比,表达量明显增加；抑制细胞凋亡的基因（如bcl-2, caspase3, c-fos, cyclin Dl）与对照组相比,表达量明显降低。mRNA水平与蛋白质水平结果一致。2.动物实验部分：（1）成功建立动物模型。（2）PTH1-34对大鼠成骨细胞的作用：给予40μg/Kg PTH1-34的大鼠检测结果与细胞实验一致,且mRNA水平与蛋白质水平结果一致。（3）PTH37-84对大鼠成骨细胞的作用：给予40μg/Kg PTH37-84的大鼠检测结果与细胞实验一致,且mRNA水平与蛋白质水平结果一致。结论1.我们成功培养了大鼠原代成骨细胞。细胞实验证实10-9 mol/L浓度的PTH1-34可能具有抑制大鼠原代成骨细胞凋亡的作用。1O-9 mol/L浓度的PTH37-84可能具有促进大鼠原代成骨细胞凋亡的作用。2.我们成功构建了去除甲状腺和甲状旁腺的动物模型。动物实验证实40μg/Kg的PTH1₃4可能具有抑制大鼠成骨细胞凋亡的作用。而40μg/Kg的PTH37-84可能具有促进大鼠成骨细胞凋亡的作用。3.细胞实验和动物实验都初步证实PTH1-34可能具有抑制细胞凋亡的作用,而PTH37-84则具有促进细胞凋亡的作用。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-11
符号说明  11-13
前言  13-17
  研究现状、成果  13-15
  研究目的、方法  15-16
  实验流程  16-17
甲状旁腺激素羧基端肽段生物学作用的研究  17-51
  对象和方法  17-29
  结果  29-40
  讨论  40-51
结论  51-52
参考文献  52-59
发表论文和参加科研情况说明  59-60
附录  60-64
综述  64-76
  综述参考文献  71-76
致谢  76

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