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肺炎嗜衣原体MOMP核酸疫苗的构建及其免疫效果的初步研究

作　者: 谢长青
导　师: 吴移谋
学　校: 南华大学
专　业: 病原生物学
关键词: 肺炎嗜衣原体 外膜蛋白 核酸疫苗 免疫活性
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


目的:构建肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae, Cpn)重组单基因疫苗和双基因融合疫苗,建立动物感染模型,比较两种核酸疫苗在抗Cpn感染中的免疫效果。为研制高效、新型的Cpn核酸疫苗奠定实验基础。方法:用Prime软件分析Cpn外膜蛋白MOMP和人IL-2基因序列,设计相应特异性引物,分别用PCR和RT-PCR扩增MOMP全基因及人IL-2基因,同时以编码6个氨基酸的18个寡核苷酸作为接头,通过重组PCR法将MOMP与IL-2基因融合,PCR产物经酶切纯化后克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体中;阳性克隆经双酶切及测序鉴定后,大量制备纯化后作为核酸疫苗,分别将重组质粒pcDNA3.1(+)-MOMP、pcDNA3.1(+)-IL-2、pcDNA3.1(+)-MOMP-IL-2及对照空质粒pcDNA3.1(+)分组注射于BALB/c小鼠后腿股四头肌,每次剂量为100μg,末次免疫后2w,免疫荧光组化法检测肺炎嗜衣原体MOMP基因在小鼠组织内的表达情况,无菌分离小鼠脾细胞,经特异性重组蛋白抗原刺激后, ELISA双抗体夹心法测定培养上清中IFN-γ水平,ELISA间接法测定BALB/c小鼠血清中抗MOMP和抗MOMP-IL-2特异性抗体水平;MTT法、淋巴细胞转化试验测定脾淋巴细胞特异性增殖反应。结果:1.成功构建了MOMP、IL-2以及MOMP-IL-2融合基因的原核表达载体和真核表达载体。2.成功构建pcDNA3.1(+)-MOMP、pcDNA3.1(+)-MOMP-IL-2融合基因核酸疫苗,其均能在组织细胞内有效表达融合靶蛋白。3.小鼠接种疫苗后,能产生特异性抗体,6w后抗体的最高滴度均达1:12804. MOMP单基因核酸疫苗组和MOMP-IL-2融合基因核酸疫苗组的鼠脾淋巴细胞经相应特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ均显著升高(分别升至586±42.3pg/mL、695±43.7pg/mL)。5. MOMP单基因核酸疫苗组和MOMP-IL-2融合基因核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经相应特异性抗原刺激后,其刺激指数分别为(1.508±0.010、1.573±0.012)。6.在小鼠肌组织中用PCR可检测到MOMP基因。结论:1. Cpn MOMP单基因核酸疫苗和MOMP-IL-2融合基因核酸疫苗均能刺激机体产生较强细胞免疫应答和体液免疫应答。2.双基因核酸疫苗诱生特异性抗体的效率与单基因核酸疫苗有明显差异;且能诱导更强,更持久的细胞免疫应答。

全文目录


中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
1 引言  11-14
2 实验材料  14-17
  2.1 主要仪器设备及材料  14-15
  2.2 主要实验试剂  15-17
3 实验方法  17-40
  第一部分 Cpn 真核表达重组体的构建及鉴定  17-30
    1.1 真核表达重组体pcDNA3.1(+)-MOMP 的构建及鉴定  17-22
    1.2 真核表达重组体pcDNA3.1(+)-IL-2 的构建及鉴定  22-25
    1.3 真核表达重组体pcDNA3.1(+)-MOMP-IL-2 的构建及鉴定  25-30
  第二部分 原核表达重组体的构建及鉴定  30-35
    2.1 原核表达pET-30a/MOMP、pET-30a/IL-2 及 pET-30a  30-32
    2.2 原核重组蛋白抗原的制备  32-35
  第三部分 MOMP 单基因核酸疫苗和MOMP-IL-2 融合核酸疫苗免疫活性的比较研究  35-40
    3.1 核酸疫苗的制备及纯化  35-36
    3.2 核酸疫苗的免疫接种  36-37
    3.3 免疫活性评价  37-40
4 实验结果  40-50
  第一部分 Cpn 真核表达载体的构建及鉴定  40-50
    1 目的基因的PCR 扩增  40-41
      1.1 Cpn MOMP 基因及L-MOMP 的 PCR 扩增  40
      1.2 人IL-2 基因及 IL-2-L 的 PCR 扩增  40-41
      1.3 融合基因MOMP-IL-2 的 PCR 扩增  41
    2 真核重组质粒的构建及鉴定  41-43
      2.1 真核重组质粒的PCR 及双酶切鉴定  41-42
      2.2 真核重组质粒测序及比对分析  42-43
    3 原核表达重组体的构建、表达及鉴定  43-45
      3.1 原核重组体的PCR 及双酶切鉴定  43
      3.2 原核重组体在E.coli BL21 中的表达  43-44
      3.3 原核重组蛋白的Western blot 鉴定  44
      3.4 重组蛋白MOMP 的初步纯化  44-45
    4 真核表达载体pcDNA3.1(+)/MOMP、pcDNA3.1(+)/ MOMP-IL-2 在小鼠组织内的表达  45-46
    5 pcDNA3.1(-)/MOMP核酸疫苗免疫活性的初步研究  46-49
      5.1 血清特异性抗体的检测  46-47
      5.2 细胞免疫水平检测  47-49
    6 PCR 检测MOMP 基因在BALB/c 小鼠肌细胞中存在  49-50
5 讨论  50-53
6 结论  53-54
参考文献  54-58
附录  58-68
文献综述  68-73
研究成果及发表论文  73-74
致谢  74

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
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