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荧光假单胞菌蛋白酶水解牛乳特性及免疫功能研究

作　者: 孙妍
导　师: 邱承光；母智深
学　校: 华中农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 荧光假单胞菌蛋白酶(PFP) 牛乳蛋白酶学特性水解免疫活性
分类号: S879.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

为了初步探索荧光假单胞菌蛋白酶(Pseudomonas Fluorescens Protease,PFP)水解牛乳的特性以及水解物的免疫活性,先就PFP对牛乳中主要蛋白质的水解特性进行了试验研究,确定了水解的最佳条件,并在此基础上,进一步研究了牛乳的PFP水解物对小鼠免疫功能的影响。本试验研究包括以下三个部分:1.PFP酶学性质的初步研究:对PFP的含量、活性、酶的最适温度及pH值进行了研究。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)确定了经过盐析、超滤、离子交换层析、疏水层析和凝胶层析后的蛋白酶达到了电泳纯;通过考马斯亮蓝法测定酶的含量;通过偶氮酪蛋白法测定酶的活性及酶的最佳温度与pH值。结果表明:得到的PFP为电泳纯蛋白酶;酶的含量为62.37μg/mL;酶的活性为17333 U/mL;酶的最佳温度为40℃,最佳pH值为7.5。2.PFP水解牛乳蛋白特性的研究:就PFP对牛乳中主要六种蛋白质的水解特性进行了试验研究,确定了形成免疫活性肽的最佳条件。PFP水解牛乳中六种蛋白质后形成的水解物分别用SDS-PAGE和反相高效液相色谱(Reverse phase-highperformance liquid chromatograph,RP-HPLC)法检测,通过正交试验优化了水解工艺参数。结果表明:α_s-CN、β-CN、κ-CN均在PFP作用下得以水解,而BSA、α-la、β-lg三种乳清蛋白均未被水解。以RP-HPLC方法对PFP水解酪蛋白形成的免疫活性肽的测定,在通过210 nm处检测最大吸收峰面积得出最佳水解工艺参数:水解时间为3 h、水解pH 6.5、水解温度40℃、蛋白酶与底物浓度比为1:200(v/v)。3.PFP水解脱脂乳粉产物免疫活性的研究:试验研究了脱脂乳粉的PFP水解物对小鼠免疫功能的影响。受试小鼠分别灌喂生理盐水、低剂量(100 mg/Kg.bw)及高剂量(250 mg/Kg.bw)PFP水解脱脂乳粉形成的水解产物,30 d后测定小鼠免疫活性指标,就水解物对小鼠免疫功能的影响进行了试验研究。结果显示:高、低剂量饲喂对小鼠生长均无显著影响;低剂量饲喂可增强脾脏指数(P＜0.05),而对胸腺指数影响不明显;高剂量饲喂可增强单核巨噬细胞吞噬功能(P＜0.05);低剂量饲喂24 h及高剂量饲喂48 h均显著提高小鼠迟发型变态反应(P＜0.05),而低剂量饲喂48 h及高剂量饲喂24 h小鼠迟发型变态反应及抗体细胞生成能力均有极显著的增强作用(P＜0.01);表明脱脂乳粉的PFP水解物可以提高小鼠免疫功能。通过完成三个部分的试验研究,可以得出PFP是一种对热有一定的耐受性的蛋白酶,该蛋白酶可水解牛乳中的酪蛋白,但不水解乳清蛋白,且水解物均含有免疫活性肽。PFP对酪蛋白酶解形成免疫活性肽的水解时间为3 h、水解PH 6.5、水解温度40℃,酶与底物浓度比为1:200(v/v);PFP水解脱脂乳粉物可以促进小鼠免疫器官的发育、刺激吞噬细胞的吞噬功能、增强迟发性变态反应以及增加抗体的生成数,因此可以提高小鼠免疫功能。本研究对PFP的合理利用提供了一条新的思路,同时为免疫活性肽的形成提供一条可行的技术思路,并丰富了牛乳源免疫活性肽的内容。

全文目录

目录  4-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略语表  11-12
第一章文献综述  12-26
  1 课题的提出  12
  2 牛乳源免疫活性肽及其进展  12-21
    2.1 牛乳中游离的生物活性肽  13-14
    2.2 动物源蛋白酶水解后形成的免疫活性肽  14-19
      2.2.1 胰蛋白酶水解后形成的免疫活性肽  14-16
      2.2.2 胃蛋白酶水解后形成的免疫活性肽  16-17
      2.2.3 凝乳酶水解后形成的免疫活性肽  17-18
      2.2.4 其他动、植物及微生物蛋白酶水解后形成的免疫活性肽  18-19
    2.3 食品发酵过程中形成的免疫活性肽  19-20
    2.4 牛乳源免疫活性肽的应用及研究展望  20-21
  3 牛乳源活性肽的免疫调节活性  21-25
    3.1 前言  21
    3.2 对免疫器官生长发育的影响  21-22
    3.3 对免疫细胞增殖与活性的影响  22-23
      3.3.1 对免疫活性细胞增殖与活性的影响  22-23
      3.3.2 对免疫辅佐细胞的影响  23
    3.4 对免疫因子增值与活性的影响  23-24
      3.4.1 对细胞因子增值与活性的影响  23-24
      3.4.2 对补体及抗体的影响  24
    3.5 牛乳源免疫活性肽的重要性  24-25
  4 本研究的目的、意义、创新点以及技术路线  25-26
第二章 PFP酶学特性初步研究  26-33
  1 材料与方法  26-30
    1.1 材料  26-27
      1.1.1 蛋白酶  26
      1.1.2 主要试剂  26
      1.1.3 主要仪器  26-27
    1.2 方法  27-30
      1.2.1 酶电泳纯的鉴定  27-28
      1.2.2 蛋白质含量的测定(Bradford，1976)  28-29
      1.2.3 酶活性的测定(Secades et al.，2001)  29
      1.2.4 酶最佳温度的选择  29
      1.2.5 酶最佳pH的选择  29-30
  2 结果与分析  30-32
    2.1 PFP电泳纯鉴定  30
    2.2 PFP蛋白含量结果与分析  30-31
    2.3 酶最佳温度与pH值的确定  31-32
      2.3.1 PFP最佳温度的确定  31-32
      2.3.2 PFP最佳pH的确定  32
  3 讨论  32-33
第三章 PFP水解牛乳蛋白特性的研究  33-42
  1 材料与方法  33-37
    1.1 材料  33-34
      1.1.1 蛋白酶  33
      1.1.2 主要试剂  33-34
      1.1.3 主要仪器  34
    1.2 方法  34-37
      1.2.1 SDS-PAGE对PFP水解牛乳中主要蛋白质的分析  34-35
      1.2.2 RP-HPLC对免疫活性肽标准品的鉴定  35-36
      1.2.3 RP-HPLC对PFP水解酪蛋白的分析  36-37
  2 结果与分析  37-41
    2.1 PFP水解牛乳中主要蛋白质的SDS-PAGE分析  37-38
      2.1.1 三种乳清蛋白的SDS-PAGE图谱  37
      2.1.2 三种酪蛋白的SDS-PAGE图谱  37-38
      2.1.3 PFP对牛乳中主要蛋白质水解情况  38
    2.2 RP-HPLC对免疫活性肽标准品的分析  38-39
    2.3 PFP水解酪蛋白的RP-HPLC分析  39-41
      2.3.1 正交法优选PFP水解酪蛋白结果  39-40
      2.3.2 水解物免疫活性肽的鉴定  40-41
  3 讨论  41-42
第四章 PFP水解脱脂乳粉的免疫功能实验  42-55
  1 材料与方法  42-46
    1.1 材料  42-43
      1.1.1 免疫活性肽  42
      1.1.2 主要试剂  42-43
      1.1.3 主要仪器  43
    1.2 方法  43-46
      1.2.1 动物的管理及饲喂方法  43-44
      1.2.2 小鼠体重、免疫器官重及免疫器官指数实验  44
      1.2.3 小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的测定(碳廓清实验)  44-45
      1.2.4 小鼠迟发性变态反应(DTH)的测定(足趾增厚法)  45
      1.2.5 抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)  45-46
  2 结果与分析  46-54
    2.1 对小鼠体重、免疫器官重及免疫器官指数影响  46-52
      2.1.1 对小鼠体重的影响  46-50
      2.1.2 对免疫器宫和免疫器官指数的影响  50-52
    2.2 对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响  52
    2.3 对小鼠迟发性变态反应的影响  52-53
      2.3.1 对24h小鼠迟发性变态反应的影响  52-53
      2.3.2 对48h小鼠迟发性变态反应的影响  53
    2.4 对抗体生成细胞的影响  53-54
  3 讨论  54-55
结论与讨论  55-57
  1 结论  55
  2 讨论  55-57
参考文献  57-63
致谢  63-64
附录试验图谱  64

荧光假单胞菌蛋白酶水解牛乳特性及免疫功能研究

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