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犬细小病毒VP2基因的克隆、表达及其重组蛋白的抗原性研究

作　者: 陈胜男
导　师: 简子健
学　校: 新疆农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 犬细小病毒 VP2基因原核表达免疫活性
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

犬细小病毒感染是由犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)引起的一种高度接触性传染病。其传播速度快,发病率和死亡率高,对家犬、经济动物及野生动物危害很大。目前,该病尚无有效的治疗方法。对其防治主要以弱毒疫苗免疫预防为主,但弱毒疫苗在使用过程中存在不安全问题,因此,急需一种安全有效的新型疫苗来预防该疾病。由于CPV的主要抗原位点位于VP2蛋白上,因此,VP2基因及其编码蛋白已成为研究犬细小病毒的热点。本研究工作主要包括以下四部分：1.犬细小病毒巢式PCR检测方法的建立及应用从临床上疑似感染CPV的犬粪便中提取总DNA。根据GenBank已发表的CPV特异保守的VP2基因序列设计二对引物,扩增出目的条带,进行测序。结果表明与国际标准的CPV VP2基因序列的同源性为99.3-100%。通过摸索重复性、特异性、敏感性试验,建立了巢式PCR方法。此方法具有良好的特异性和敏感性,适合于犬细小病毒的检测和分子流行病学调查。2.犬细小病毒VP2基因的克隆及序列分析根据GenBank中已发表的犬细小病毒基因序列,设计一对特异性引物,以巢式PCR检测的阳性样品DNA为模板,经PCR扩增,获得目的基因,将目的基因进行测序,结果显示,序列全长为1755bp,其核苷酸与国外和中国各地区流行株的同源性较高,介于98.4～99.8%之间,表明本研究成功克隆了CPV VP2基因。3.犬细小病毒VP2基因的原核表达及免疫反应性研究成功构建重组原核表达质粒pGEX-4T-VP2,用克隆的CPV VP2基因转化到E.coli BL21中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-Blotting分析,结果表明,诱导表达的pGEX-4T-VP2阳性菌株可表达出大小为90kDa蛋白,该重组蛋白具有反应活性。4.犬细小病毒VP2基因的原核表达条件优化和蛋白纯化及免疫原性研究为了确定VP2基因蛋白在大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)中表达的最佳条件,对诱导温度、诱导时间及IPTG浓度等条件进行优化。用Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化出目的蛋白。纯化的目的蛋白四次免疫小白鼠,ELISA结果显示GST-VP2融合蛋白抗血清效价随着免疫次数的增加而升高,表明得到的重组蛋白具有很好的免疫原性。可作为犬细小病毒的基因工程亚单位疫苗候选者。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
第1章犬细小病毒研究进展  8-21
  1.1 犬细小病毒病原学特征  8-10
  1.2 犬细小病毒生物学特性  10-12
  1.3 犬细小病毒病的流行病学  12-13
  1.4 发病机理  13
  1.5 临床症状  13-14
  1.6 犬细小病毒的诊断方法  14-17
  1.7 预防与控制  17-20
  1.8 研究目的和意义  20-21
第2章犬细小病毒巢式PCR检测方法的建立及应用  21-29
  2.1 材料  21
  2.2 方法  21-25
  2.3 结果  25-28
  2.4 讨论  28-29
第3章犬细小病毒VP2基因的克隆与序列分析  29-39
  3.1 材料  29
  3.2 方法  29-34
  3.3 结果  34-37
  3.4 讨论  37-39
第4章犬细小病毒VP2基因在BL21表达及免疫反应性研究  39-46
  4.1 材料  39
  4.2 方法  39-43
  4.3 结果  43-44
  4.4 讨论  44-46
第5章犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白的纯化及免疫原性研究  46-55
  5.1 材料  46-47
  5.2 方法  47-50
  5.3 结果  50-53
  5.4 讨论  53-55
第6章结论  55-56
参考文献  56-63
附录Ⅰ 常用试剂及配制  63-67
附录Ⅱ 仪器设备  67-68
致谢  68-69
个人简历  69

犬细小病毒VP2基因的克隆、表达及其重组蛋白的抗原性研究

内容摘要

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