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密码子优化对乙肝病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗免疫原性的影响

作　者: 杜合娟
导　师: 郉益平
学　校: 南京医科大学
专　业: 内科学
关键词: 密码子优化乙型肝炎表面抗原核酸疫苗免疫原性
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景:乙型病毒性肝炎是我国流行最广、感染者最多的传染病之一,对人民的身体健康造成了极大的威胁。乙型肝炎病毒核酸疫苗是一种治疗性核酸疫苗,已经证明在多种动物体内可以诱导特异性的细胞免疫和体液免疫。然而,其免疫原性仍然不能令人满意,有待进一步提高。由于原核生物和真核生物在密码子使用上具有偏嗜性,可能会导致用来构建核酸疫苗的目的基因等外源基因在高级哺乳动物宿主体内的表达量较低,从而不能有效的激活宿主的免疫系统,目前认为这可能是核酸疫苗免疫原性较低的因素之一。核酸疫苗的密码子优化是按照哺乳动物密码子使用偏好,在不改变基因编码蛋白质氨基酸序列的基础上,对核酸疫苗的目的基因进行优化,希望提高其在哺乳动物细胞中的蛋白表达量,增强核酸疫苗的免疫原性。国内外的学者通过对人乳头瘤病毒(HPV)、获得性免疫缺陷病毒(HIV)及流感病毒等核酸疫苗的目的基因进行密码子优化,提高了疫苗的蛋白表达量及免疫原性。应用密码子优化方法构建经密码子优化的乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗,来研究密码子优化对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗免疫原性的影响,对于设计具有更强免疫原性的新型乙肝疫苗有着重要的意义。目的:观察密码子优化能否增强乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗在体外的蛋白表达量及免疫小鼠的体液免疫应答及细胞免疫应答。方法:根据乙型肝炎病毒(adr亚型)表面抗原中蛋白(MHBs)的氨基酸序列资料,在不改变其氨基酸序列的基础上,按照哺乳动物细胞密码子使用偏好,设计并人工合成了密码子优化的MHBs基因。然后,将密码子优化的MHBs基因克隆到核酸疫苗载体pSW3891中,构建了密码子优化的表达MHBs核酸疫苗(命名为:pSW3891/MHBs/adr/opt,简称opt)。用上述核酸疫苗与表达野生型MHBs核酸疫苗(命名为:pSW3891/MHBs/adr,简称adr)及空载体质粒pSW3891一起瞬时转染293T细胞,应用蛋白质印迹法检测转染细胞中MHBs的表达。在此基础上,采用肌肉注射法,以opt、adr疫苗及空载体pSW3891分别对BALB/c小鼠进行免疫。免疫的时间点为第0、2、4和6周。于免疫前和每次免疫后两周收集血清,用ELISA方法检测免疫后小鼠血清中HBs抗体的滴度。于第四次免疫后两周处死小鼠,无菌取脾细胞,用ELISPOT法检测免疫小鼠表面抗原特异性分泌IFN-γ的脾细胞数量。结果:BamH1及Pst1双酶切和直接序列测定结果提示密码子优化的乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗构建成功。蛋白质印迹法结果显示opt和adr均可在体外293T细胞中高效表达,且opt的蛋白表达量要高于野生型。ELISA实验结果表明,opt和adr疫苗分别以肌肉注射方式免疫BALB/c小鼠后,在第一次免疫后两周,两组免疫动物血清中开始检测到特异性的抗-HBs抗体,在第四次免疫后:小鼠特异性抗体滴度达到最高峰。在相同时间点,opt免疫组小鼠血清中特异性的抗-HBs抗体的OD值均高于adr免疫组小鼠;opt免疫组小鼠第8周抗-HBs滴度达1:364500,明显高于adr免疫组小鼠(1:121500)。ELISPOT结果显示,四次免疫后opt免疫组小鼠表面抗原特异性分泌IFN-γ的脾细胞数量平均约为165.9个/5×10~5细胞,显著的高于adr免疫组小鼠(90.7个/5×10~5细胞)。结论:密码子优化可以增强乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗在体外293T细胞中的蛋白表达量及免疫小鼠的体液免疫应答和细胞免疫应答。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
前言  9-14
  参考文献  11-14
正文密码子优化对乙肝病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗免疫原性的影响  14-49
  1. 引言  14-15
  2. 材料和方法  15-30
  3. 结果  30-40
  4. 讨论  40-44
  5. 小结  44-45
  参考文献  45-49
文献综述  49-59
  参考文献  54-59
附录:中英文缩写对照表  59-61
攻读学位期间发表文章情况  61-67
  1. 硕士期间发表论文目录  61-62
  2. 硕士期间发表论文  62-67
致谢  67

密码子优化对乙肝病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗免疫原性的影响

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