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牛呼吸道合胞体病毒分离鉴定及重组N蛋白间接ELISA诊断方法的建立

作　者: 王红
导　师: 朴范泽；侯喜林
学　校: 黑龙江八一农垦大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛呼吸道合胞体病毒分离鉴定核衣壳蛋白克隆原核表达间接ELISA
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

根据GenBankTM上发表的牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)核衣壳(N)蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,扩增大小为596bp的目的片段,通过特异性试验、敏感性试验和重复性试验建立了BRSV RT-PCR检测方法。该方法敏感度可达1 TCID50/mL,与牛腺病毒、牛副流感病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛无浆体均无交叉反应。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异性强和重复性好等特点,可作为BRSV检测的一种方法。从黑龙江省暴发疑似牛呼吸道合胞体病的牛场无菌采集病牛的鼻汁,按常规方法处理后,接种Vero细胞,获得一株病毒。该分离毒能使Vero细胞产生稳定且典型的合胞体形态的细胞病变(CPE),对5-碘脱氧尿核苷不敏感,对乙醚、氯仿、胰酶、酸均敏感,不耐热,二价镁离子对该病毒不具有保护作用,且无血凝性和血吸附特性;该病毒能被BRSV标准阳性血清中和;应用特异性引物,对病毒细胞培养物进行RT-PCR检测,从中扩增出BRSV N基因中596bp的特异性片段,并且分离株与GenBankTM中BRSV毒株N基因相应片段的核苷酸序列同源性为97.8%～99.3%。结果表明所分离到的病毒为牛呼吸道合胞体病毒,命名为BRSV HJ株。提取BRSV HJ株细胞培养上清中的总RNA,应用RT-RCR方法扩增得到N蛋白基因,并克隆到pMD18-T载体上,筛选、鉴定阳性重组子pMD18-T-N,然后克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,经双酶切、PCR鉴定,获得重组表达质粒pET-30a-N。序列分析证实,构建的重组质粒pET-30a-N中含有完整的N蛋白基因,并且分离株与GenBankTM中BRSV毒株N蛋白基因之间的核苷酸和推导的氨基酸同源性分别在97.5%～99.1%之间和98.7%～99.2%之间。将含有pET-30a-N的重组菌BL21(DE3),经终浓度为1mmol/L的IPTG诱导后,重组N蛋白获得高效表达。Western blot检测结果表明表达的重组N蛋白具有良好的反应原性。利用纯化后的重组N蛋白作为抗原,建立检测BRSV抗体的间接ELISA方法。通过对间接ELISA各反应条件的优化,确定了最佳反应条件为:抗原的最佳包被液为50mM pH9.6的碳酸盐缓冲液;抗原最佳包被浓度为5.0μg/mL;最佳封闭液为5%脱脂奶粉,封闭条件为37℃1h;最佳血清稀释液为5%脱脂奶粉,血清稀释倍数为100倍;HRP-兔抗牛IgG的最适工作浓度为1︰5 000。包被的重组抗原不与牛无浆体病、牛传染性鼻气管炎和牛副流感阳性血清发生交叉反应,表明建立的ELISA方法具有良好的特异性。与中和试验相比较,该方法的特异性、敏感性和符合率分别为85.0%、90.9%和87.7%。应用本试验所建立的间接ELISA诊断方法检测黑龙江省部分地区的600份牛血清样本,初步查明我省部分地区BRSV的抗体阳性率为27.33%。本研究揭示了我国牛呼吸道合胞体病的存在,同时也为该病诊断试剂盒的研制奠定了基础,并为今后该病的流行病学、免疫学、致病机理和免疫预防等方面的研究提供了可靠的理论依据和有效的技术手段。

全文目录

中文摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章文献综述  10-21
  1.1 病原学  10-14
  1.2 流行病学  14-15
  1.3 临床症状  15-16
  1.4 病理变化  16
  1.5 致病机理  16
  1.6 免疫学  16-17
  1.7 诊断  17-19
  1.8 防治  19
  1.9 研究的目的与意义  19-21
第二章 BRSV RT-PCR 检测方法的建立  21-32
  2.1 材料  21-22
  2.2 方法  22-26
  2.3 结果  26-31
  2.4 讨论  31-32
第三章 BRSV 分离鉴定  32-41
  3.1 材料  32-33
  3.2 方法  33-36
  3.3 结果  36-40
  3.4 讨论  40-41
第四章 BRSV 分离株N 蛋白基因的原核表达与反应原性分析  41-54
  4.1 材料  41-42
  4.2 方法  42-46
  4.3 结果  46-53
  4.4 讨论  53-54
第五章 BRSV 重组 N 蛋白间接 ELISA 诊断方法的建立  54-65
  5.1 材料  54
  5.2 方法  54-57
  5.3 结果  57-63
  5.4 讨论  63-65
第六章结论  65-66
参考文献  66-73
致谢  73-74
附录  74-85
作者简历  85

牛呼吸道合胞体病毒分离鉴定及重组N蛋白间接ELISA诊断方法的建立

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