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表达BRSV G基因的BHV-1的构建及G蛋白的截短表达与鉴定

作　者: 冯军科
导　师: 薛飞
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛疱疹病毒Ⅰ型牛呼吸道合胞体病毒重组病毒 G基因原核表达
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是由牛疱疹病毒Ⅰ型(Bovine hepervirus-1,BHV-1)引起的一种牛的急性、热性、接触性传染病,临床上主要以高热、呼吸困难、鼻窦炎及上呼吸道炎症为特征,另外还能引起母牛流产、死胎、肠炎和小牛脑炎,时有发生眼结膜炎和角膜炎。牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)属副黏病毒科肺病毒属,是引起犊牛呼吸系统疾病的主要病原之一。两病均呈世界性分布,造成巨大经济损失。鉴于传统疫苗存在的弊端及牛疱疹病毒的特点,近年来对疱疹病毒活载体疫苗的研究受到了很大的关注。本研究构建了一株表达BRSV G基因的BHV-1,为研制BRSV活载体疫苗奠定了基础。同时截短表达了BRSV的G蛋白,表达的重组蛋白具有良好的抗原性,可用于BRSV诊断试剂的研究。为了构建表达BRSV G基因的BHV-1,将人工合成的BRSV全长G基因编码序列插入到巨细胞病毒(CMV)启动子之下构建TK基因缺失转移载体。利用磷酸钙-DNA共沉淀法将该转移载体与亲本病毒BHV-1/TK—/LacZ+的基因组DNA共转染牛鼻甲细胞后收获增殖的病毒。通过筛选白色病毒蚀斑,得到重组病毒BHV-1/TK—/G+。PCR检测结果表明G基因已经插入到了亲本病毒BHV-1/TK—/LacZ+的基因组中,Western blot和间接免疫荧光试验证实了BHV-1/TK—/G+中的G基因在感染的细胞中获得了表达。BRSV G蛋白是病毒主要的吸附蛋白,抗G蛋白的特异性抗体可以阻止病毒与细胞的结合,同时G蛋白也是BRSV的主要保护性抗原之一。经生物学软件DNA Star分析,将BRSV G基因截短成2个片段G1和G2。然后用人工合成的BRSV G基因为模板,用PCR分别扩增G1和G2基因片段,其大小分别为570 bp和308 bp。将目的片段定向克隆到pET30a表达载体中,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导后G1和G2基因片段都获得了表达,且都为可溶性表达。用Ni柱亲和层析法在非变性条件下纯化重组蛋白,经Western blot鉴定证明纯化的重组蛋白G1具有良好的抗原性和特异性,而重组蛋白G2无反应性。应用纯化的重组蛋白G1进行的间接ELISA与免疫印迹试验在国内牛血清中检测到了BRSV血清抗体。本研究所表达的重组蛋白G1为基于BRSV G蛋白的血清学诊断方法的建立与BRSV G蛋白生物学功能的研究奠定了基础。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章绪论  12-24
  引言  12
  1.1 牛呼吸道合胞体病毒简介  12-19
    1.1.1 牛呼吸道合胞体病毒的形态与分子特征  12
    1.1.2 BRSV 编码病毒蛋白概述  12-15
    1.1.3 BRSV 的流行病学  15-16
    1.1.4 BRSV 的诊断  16
    1.1.5 牛呼吸道合胞体病毒疫苗研究进展  16-19
      1.1.5.1 亚单位疫苗  16-18
      1.1.5.2 基因工程疫苗  18
      1.1.5.3 核酸疫苗  18-19
  1.2 病毒活载体疫苗的研究进展  19-23
    1.2.1 腺病毒活载体  19
    1.2.2 痘病毒活载体  19-20
    1.2.3 疱疹病毒活载体  20-23
      1.2.3.1 牛疱疹病毒活载体  20
      1.2.3.2 BHV-1 作为活病毒载体的优势  20-21
      1.2.3.3 BHV-1 活病毒载体研究中遇到的问题  21
      1.2.3.4 构建 BHV-1 活载体病毒的策略  21-22
      1.2.3.5 BHV-1 活载体病毒的应用  22-23
  1.3 研究目的和意义  23-24
第二章表达BRSV G 基因的重组BHV-1 的构建与鉴定  24-36
  2.1 材料和方法  25-28
    2.1.1 毒株、细胞与质粒  25
    2.1.2 主要试剂  25
    2.1.3 血清及标记抗体  25
    2.1.4 BHV-1 基因组 DNA 的制备  25
    2.1.5 转移载体的构建  25-26
    2.1.6 PUC18 TK/G+转移载体质粒的大量提取与纯化  26
    2.1.7 牛鼻甲细胞培养与病毒 DNA 转染  26-27
    2.1.8 重组病毒的筛选与纯化  27
    2.1.9 重组病毒的PCR 鉴定  27
    2.1.10 重组病毒TCID50 的测定  27-28
    2.1.11 重组病毒 BHV-1/TK~—/G~+中 G 基因表达的检测  28
  2.2 结果  28-34
    2.2.1 转移载体的构建及鉴定  28-30
    2.2.2 重组病毒的筛选  30
    2.2.3 重组病毒的PCR 鉴定  30
    2.2.4 重组病毒的序列测定结果  30-32
    2.2.5 重组病毒的 TCID50的测定  32
    2.2.6 重组病毒G 基因的表达检测结果  32-34
  2.3 讨论  34-36
第三章牛呼吸道合胞体病毒G 蛋白的截短表达与鉴定  36-44
  3.1 材料和方法  37-39
    3.1.1 基因、菌种和质粒  37
    3.1.2 试剂  37
    3.1.3 引物设计与合成  37-38
    3.1.4 G 基因表达载体的构建与鉴定  38
    3.1.5 G 基因的表达  38
    3.1.6 表达产物的分析与纯化  38
    3.1.7 表达产物的Western blot 鉴定  38-39
    3.1.8 重组蛋白G 间接ELISA 检测牛血清样品试验  39
    3.1.9 用重组蛋白G 检测牛血清样品的免疫印迹试验  39
  3.2 结果  39-42
    3.2.1 G 基因两个片段的扩增和克隆  39
    3.2.2 重组蛋白在表达菌中的存在形式及表达产物的纯化  39-40
    3.2.3 重组蛋白抗原性的Western blot 鉴定  40-41
    3.2.4 间接ELISA 与免疫印迹试验检测牛血清样品结果  41-42
  3.3 讨论  42-44
第四章全文结论  44-45
参考文献  45-53
附录  53-56
致谢  56-57
作者简历  57

表达BRSV G基因的BHV-1的构建及G蛋白的截短表达与鉴定

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