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人67kDa层粘连蛋白受体（67LR）在粘附介导结肠癌细胞系SW480多药耐药中的作用及其分子机制

作　者: 陆春雷
导　师: 张洪伟
学　校: 第四军医大学
专　业: 外科学
关键词: 结肠癌粘附层粘连蛋白细胞粘附介导耐药凋亡 67LR siRNA
分类号: R735.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象是导致化疗失败的主要原因。国内外已在细胞膜、细胞质和细胞核中发现了多种MDR相关分子并推测相应的分子机制,但是并不能完全解释肿瘤的MDR现象。肿瘤细胞与细胞外基质的粘附可以导致耐药,并将这种形式的耐药称为细胞粘附介导的耐药(cell adhesion mediated drug resistance,CAM-DR)。研究发现,人67kDa层粘连蛋白受体(human 67kDa laminin receptor,67LR)介导的结肠癌细胞与细胞外基质成分层粘连蛋白(laminin,LN)的粘附与肿瘤的多种生物学行为密切相关。本研究旨在研究67LR介导结肠癌细胞与细胞外基质成分LN粘附对于其药物敏感性的影响,并深入探讨67LR作为粘附分子参与结肠癌CAM-DR的分子机制,将有助于全面理解结肠癌MDR的发生和调节机制。目的:研究粘附状态下结肠癌细胞SW480对于多种化疗药物的耐受性,并初步探讨其耐药机制;以67LR表达下调的结肠癌细胞亚系为模型,在67LR与其特异性配体LN相互识别介导SW480细胞粘附的状态下,深入探讨67LR的功能及其介导结肠癌细胞CAM-DR的分子机制,将有助于全面理解结肠癌MDR的发生和调节机制。方法:第一部分:1.通过细胞粘附实验研究结肠癌细胞SW480与细胞外基质重要组分LN及阴性对照成分牛血清白蛋白(BSA)粘附能力的差别;2.通过MTT比色法检测粘附于LN以及BSA的结肠癌细胞SW480对于化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)和顺铂(DDP)的药物敏感性;3.借助流式细胞仪(FCM)检测粘附于LN以及BSA的SW480细胞内阿霉素的蓄积和潴留,并计算相应的药物泵出率;4.通过Annexin V/PI染色法检测粘附于LN以及BSA的结肠癌细胞SW480在化疗药物诱导下的凋亡,并计算相应凋亡指数。第二部分:构建67LR的siRNA载体并转染SW480细胞,筛选并建立67LR表达下调的SW480转染细胞亚系。第三部分:1.通过细胞粘附实验检测结肠癌细胞稳定转染亚系SW480-si67LR及其对照细胞与LN以及BSA的粘附能力的差别;2.通过MTT比色法检测粘附于LN以及BSA的结肠癌细胞稳定转染亚系SW480-si67LR及其对照细胞对于化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)和顺铂(DDP)的药物敏感性;3.通过Annexin V/PI染色法检测粘附于LN以及BSA的结肠癌细胞稳定转染亚系SW480-si67LR及其对照细胞在化疗药物诱导下的凋亡,并计算相应凋亡指数;4.通过Western Blot检测粘附于LN以及BSA的结肠癌细胞稳定转染亚系SW480-si67LR及其对照细胞中凋亡信号途径相关蛋白FAK的总蛋白及磷酸化蛋白、Bcl-2和Bax的表达。结果:第一部分:1.在单位时间内,LN组中结肠癌细胞SW480的粘附细胞数均明显高于BSA组(p<0.05);2.与粘附于BSA的结肠癌细胞SW480相比,粘附于LN的SW480细胞的化疗药物敏感性显著下降,对于化疗药物的IC50均相应显著升高,化疗药物诱导的凋亡指数明显减少;细胞内阿霉素的蓄积和潴留均明显减少,药物泵出率显著增加(p<0.05)。第二部分:成功筛选并建立67LR表达下调的SW480转染细胞亚系。第三部分:1.在单位时间内,LN组和BSA组内67LR表达水平下调的结肠癌转染细胞SW480-si67LR的粘附细胞数均明显低于其对照细胞(p<0.05);2.与LN粘附后,在结肠癌转染细胞SW480-si67LR及其对照细胞中均检测到磷酸化FAK的不同程度的表达,其中SW480-si67LR中磷酸化FAK的表达水平表达明显下调,其相对表达率具有显著的统计学差异(p<0.05);3.与对照成分BSA粘附后,在结肠癌转染细胞SW480-si67LR及其对照细胞中均检测不到磷酸化FAK的不同程度的表达;4.与LN及其对照成分BSA粘附后,SW480-si67LR及其对照细胞中总FAK的表达无统计学差异(p<0.05);5.在与LN粘附条件下,与其对照细胞相比67LR表达水平下调的结肠癌转染细胞SW480-si67LR的化疗药物敏感性显著上升,对于化疗药物的IC50相应显著下降,化疗药物诱导的凋亡指数明显增加;细胞内Bcl-2的表达显著降低,Bax表达显著增强(p<0.05)。结论:1.与细胞外基质成分LN粘附后,结肠癌细胞可能通过以下两种途径增强自身的多药耐药性:i.提高肿瘤细胞对药物转运的能力,导致化疗药物在肿瘤细胞内蓄积的减少;ii.提高抗凋亡的能力,导致逃避对化疗药物诱导的凋亡;2. 67LR与结肠癌细胞的粘附能力密切相关,下调67LR的表达水平,结肠癌细胞的粘附能力显著减弱;3.当结肠癌细胞SW480膜表面的67LR与其特异性配体LN(细胞外基质成分)相互识别而介导细胞粘附后,可能通过诱导细胞内FAK的磷酸化而激活凋亡相关通路,从而能够上调Bcl-2及下调Bax的表达水平,从而抑制了化疗药物诱导的粘附状态下结肠癌细胞的凋亡。

全文目录

缩略语表  6-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-14
前言  14-15
文献回顾  15-26
正文  26-52
  第一部分粘附介导的结肠癌细胞系SW480 的多药耐药性  26-35
    1. 实验材料  26
    2. 主要仪器  26-27
    3. 实验方法  27-31
    实验结果  31-34
      1 结肠癌细胞SW480 粘附特征的检测  31-32
      2 粘附于细胞外基质对结肠癌细胞化疗药物敏感性的影响  32
      3 粘附于细胞外基质对结肠癌细胞内阿霉素蓄积和潴留的影响  32
      4 粘附于细胞外基质对结肠癌细胞的化疗药物诱导的凋亡的影响  32-34
    讨论  34-35
  第二部分 67LR 表达下调的SW480 细胞亚系的建立及鉴定  35-45
    1 实验材料  35-36
    2 主要仪器  36
    3 实验方法  36-41
    实验结果  41-43
      1. 67LR 小干扰RNA 载体的构建  41
      2. 转染细胞鉴定  41-43
    讨论  43-45
  第三部分 67LR 在粘附介导的结肠癌细胞系SW480 多药耐药中的作用及其分子机制  45-52
    1. 实验材料  45
    2. 主要仪器  45
    3. 实验方法  45-46
    实验结果  46-51
      1. 结肠癌转染细胞亚系的粘附特征的检测  46-47
      2. 粘附于细胞外基质成分（LN）对结肠癌转染细胞亚系化疗药物敏感性的影响  47-48
      3. 粘附于细胞外基质对结肠癌稳定转染细胞的化疗药物诱导的凋亡的影响  48-49
      4. 细胞粘附对于结肠癌稳定转染细胞内凋亡信号途径相关蛋白的表达的影响  49-51
    讨论  51-52
小结  52-53
参考文献  53-58
个人简历和研究成果  58-59
致谢  59

人67kDa层粘连蛋白受体（67LR）在粘附介导结肠癌细胞系SW480多药耐药中的作用及其分子机制

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