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淋巴瘤Raji细胞Id4基因甲基化检测及As_2O_3抑制效应研究

作　者: 赵春华
导　师: 曲凡
学　校: 河北医科大学
专　业: 儿科学
关键词: As2O3 淋巴瘤 甲基化 Id4 特异性聚合酶链反应 凋亡 细胞周期
分类号: R733.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的:恶性淋巴瘤是淋巴干细胞分化异常克隆性增殖的肿瘤,为儿童期最常见的恶性肿瘤之一,发病率有逐年增高之势。其确切病因不明,目前传统化疗仍是其治疗的主要手段,但耐药及化疗的毒副作用是影响长期生存的重要因素之一。因而,探索病因、寻求一种更为有效的防治措施对改善患儿的预后和生活质量具有十分重要的意义。DNA结合抑制因子（inhibitor of DNA binding, Id）是DNA结合抑制剂。于力教授在动物肿瘤模型中发现Id4基因启动子区高甲基化导致了Id4基因沉默,首次证明Id4基因是一个新的抑癌基因。恶性淋巴瘤Id4基因是否亦发生了甲基化文献报道较少。DNA甲基化抑制剂能逆转甲基化效应,三氧化二砷（As2O3）是近年国内首先发现并被成功用于急性早幼粒细胞白血病（APL）等多种恶性血液病的诱导分化治疗,取得了很好的疗效。研究发现,As2O3在体内可被还原发生甲基化,从而干扰体内的DNA甲基化模式,提示As2O3可能用于恶性血液病的去甲基化治疗,但目前国内外对于As2O3被用于去甲基化治疗恶性淋巴瘤报道甚少。本实验选用人Burkitt’s淋巴瘤细胞株Raji细胞,用甲基化特异性聚合酶链反应（MS-PCR）方法检测Id4基因甲基化状态,并用As2O3处理Raji细胞,通过观察As2O3对Raji细胞增殖、凋亡、细胞周期分布及对Id4基因甲基化程度及其表达的影响,探讨As2O3对恶性淋巴瘤的作用及As2O3治疗恶性淋巴瘤的可能机制;为恶性淋巴瘤的发病机制提供新的理论依据及治疗对策,为去甲基化药物治疗恶性淋巴瘤提供实验室资料。方法:体外培养人Burkitt’s淋巴瘤细胞株Raji细胞,用MS-PCR法检测Raji细胞的Id4基因甲基化状态,并用不同浓度的As2O3处理Raji细胞。应用MTT比色法检测细胞生长情况;流式细胞术（FCM）分析As2O3对细胞周期的影响并检测细胞凋亡;MS-PCR法检测As2O3处理前后Id4基因甲基化程度的改变,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测处理前后Id4 mRNA的表达情况。结果1 MS-PCR法检测结果显示:Raji细胞用甲基化特异性引物扩增可见155bp特异性扩增产物条带,非甲基化特异性引物扩增未见特异性扩增产物条带,表明Raji细胞的Id4基因呈完全甲基化状态。2 MTT比色试验结果表明:As2O3各浓度组作用于Raji细胞24h后抑制率分别为12.15%,33.72%,38.99%,62.06%;48h后抑制率分别为21.86%,45.38%,52.10%,75.79%;72h后抑制率分别为40.03%,66.64%,74.09%,92.17%。各实验组作用于Raji细胞24、48、72h后细胞抑制率与对照组相比均有显著性差异（P<0.05）,同时各浓度组之间以及时间组之间均有显著性差异（P<0.05）。3流式细胞术检测结果显示:As2O3各浓度组作用于Raji细胞48h后出现明显的凋亡峰,其凋亡率分别为（8.93±0.24）% , （24.21±0.97）% , （33.54±0.83）% ,（44.76±1.21）%;对照组未见凋亡峰或仅有低平的凋亡峰,其凋亡率为（1.97±0.73）%。用最小显著差法两两比较,各实验组与对照组相比均具有显著性差异（P<0.05）。经单因素方差分析,各浓度组间As2O3对细胞凋亡率的影响有显著性差异（P<0.05）。4流式细胞术分析结果显示:As2O3各浓度组作用于Raji细胞48h后,各处理组G0/G1期细胞比例分别为（50.41±0.70）% , （61.87±0.89）% , （68.31±0.12）% ,（74.97±0.31）% ; S期细胞比例分别为（39.13±0.63）% ,（28.83±1.84）%,（23.62±0.11）%,（17.57±0.18）%;G2/M期细胞比例分别为（10.46±0.07）%,（9.30±0.30）%,（8.07±0.06）%,（7.46±0.06）%,对照组处于G0/G1期,S期,G2/M期细胞的比例分别为（44.85±0.73）% , （43.78±0.27）% ,（11.38±0.16）%。与对照组相比,As2O3各实验组细胞周期发生明显变化（P<0.05）。经单因素方差分析,各浓度组间As2O3对细胞周期的影响有显著性差异（P<0.05）。5 MS-PCR检测结果显示:3μmol/L浓度组呈完全甲基化状态,6μmol/L及9μmol/L浓度组呈部分甲基化状态,12μmol/L浓度组呈完全非甲基化状态,提示Raji细胞Id4基因高甲基化状态可被As2O3逆转,且与As2O3的剂量有关。6 RT-PCR检测结果显示:除3μmol/L外,Raji细胞经6μmol/L,9μmol/L,12μmol/L As2O3各浓度组作用48h后,随着药物浓度增加,Raji细胞中Id4基因mRNA的相对表达量逐渐增加,呈一定剂量依赖关系。结论1人Burkitt’s淋巴瘤细胞株Raji细胞中Id4基因呈完全甲基化状态。2 As2O3可以逆转Raji细胞Id4基因的髙甲基化状态,使Id4 mRNA重新表达,且在612μmol/L范围内呈一定剂量依赖关系。As2O3去甲基化作用可能是其治疗恶性血液肿瘤的机制之一。3 As2O3体外对Raji淋巴瘤细胞生长具有明显的抑制作用,且在312μmol/L范围内呈时间、剂量依赖性。4 As2O3能诱导Raji细胞凋亡,且使G0/G1期细胞比例增加,同时S期及G2/M期细胞比例减少。5 Raji细胞Id4基因呈高甲基化状态是其恶性增殖的原因之一。

全文目录


中文摘要  4-8
英文摘要  8-13
研究论文 淋巴瘤Raji 细胞Id4 基因甲基化检测及 As_2O_3抑制效应研究  13-46
  前言  13-14
  材料和方法  14-24
  结果  24-27
  附图  27-33
  附表  33-34
  讨论  34-42
  参考文献  42-46
综述  46-70
致谢  70-71
个人简历  71

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 网状内皮系统肿瘤
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