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ADAM23在非小细胞肺癌中的表达与启动子甲基化相关性的研究

作　者: 胡春燕
导　师: 周建华
学　校: 中南大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 甲基化特异性聚合酶链反应(MSP) 去整合素-金属蛋白酶23 ανβ3 非小细胞肺癌 5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-dC)
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一。在欧美国家已成为主要的死亡原因之一[1-2],其主要原因是肺癌的发生发展和侵袭转移机制尚未完全清楚。其中细胞内癌基因的活化和／或抑癌基因的失活是导致肺癌发生的主要原因。最近研究表明,表观遗传学的改变在肺癌的发生发展过程中扮演着重要角色,其中DNA甲基化修饰异常所导致的抑癌基因的沉默在肿瘤的发生发展中起着关键性作用。因此,研究新的抑癌基因在肺癌癌变中的功能失调及其作用机制,对于阐明肺癌的发病机制、指导临床治疗具有重要意义。去整合素-金属蛋白酶23(ADisintegrin And Metalloprotease23, ADAM23)基因属于ADAM家族成员,是一种跨膜糖蛋白,介导细胞问及细胞-基质问的黏附融合,在肿瘤的侵袭和转移过程中可特异性激活其整合素受体avβ3,从而促进肿瘤新生血管的生成,加速肿瘤细胞的生长和迁移。近来研究报道ADAM23作为一种抑癌基因,其表达缺失与乳腺癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、结直肠癌等[3-7]恶性肿瘤的发生发展有密切关系,其机制与该基因启动子区CpG岛甲基化修饰异常高度相关。然而,ADAM23在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中的表达及其启动子甲基化修饰情况,以及在肺癌发生发展中的作用,目前国内外未见相关报道。本研究通过分析ADAM23在非小细胞肺癌中的表达及意义,揭示ADAM23在非小细胞肺癌发生发展中的作用,并对其启动子甲基化状态进行分析,揭示其表达下调的机制,为肺癌的治疗和预后判断提供新的靶标。目的：检测ADAM23、avβ3在非小细胞肺癌中的表达及其与患者临床病理特征的关系；分析ADAM23基因启动子区CpG岛甲基化情况与其表达的关系,为揭示ADAM23在非小细胞肺癌发病中的作用提供理论基础和实验依据。方法：(1)应用免疫组织化学技术和RT-PCR方法检测52例非小细胞肺癌及其配对癌旁组织和8例良性病变组织中ADAM23、avβ3的表达,分析其与临床病理特征的相关性。同时采用Western blotting和RT-PCR的方法检测ADAM23在肺鳞癌细胞(SK-MES-1)和肺腺癌细胞(A549, SPC-A1, LTEP-a-2)中表达。(2)应用甲基化特异性PCR (MSP)方法分别在新鲜组织和细胞中检测ADAM23基因启动子区甲基化情况,分析其与表达的相关性。(3)应用去甲基化特异性药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-dC)处理非小细胞肺癌细胞,检测药物处理前后ADAM23基因的表达和启动子区甲基化改变情况。结果：(1)非小细胞肺癌中ADAM23蛋白的阳性率(38.5%)低于癌旁组织(86.5%)及肺良性病变组织(87.5%)(P<O.05),而αvβ3蛋白的阳性率(80.8%)高于癌旁组织(26.9%)及肺良性病变组(37.5%)(P＜O.05)。ADAM23蛋白在非小细胞肺癌中的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小以及组织学分型无关,而与分化程度、淋巴结转移和临床分期关系密切；αvβ3蛋白在非小细胞肺癌中的表达与患者的年龄、性别、组织学分型以及分化程度无关,而与肿瘤的大小、淋巴结转移和临床分期有关；RT-PCR结果显示ADAM23mRNA在非小细胞肺癌中的表达略高与癌旁组织和肺良性病变组织,而αv、β3在癌中的表达明显高于癌旁组织及肺良性病变组织；ADAM23和αvβ3的表达呈负相关(X2=9.026,r=0.417,P<0.05)。(2)52例非小细胞肺癌中和配对癌旁组织及肺良性病变组织中ADAM23甲基化发生率分别为40.4%(21/52)、7.6%(4/52)和0(0/8)；其中32例ADAM23阴性表达的肺癌组织中,17例显示该基因启动子区存在甲基化；ADAM23基因的表达和启动子甲基化呈负相关(X2=5.609,r=-0.328,P=0.0 7)。(3)在4株肺癌细胞中,ADAM23在SK-MES-1和A549中的表达显著高于SPC-A1和LTEP-a-2细胞；其中甲基化特异性PCR结果显示SPC-A1,LTEP-a-2存在甲基化,仅甲基化引物扩增出产物,而SK-MES-1和A549仅非甲基化引物扩增出产物。(4) 5-Aza-2’-dC药物处理SPC-A1, LTEP-a-2细胞三天后,ADAM23表达显著增高且甲基化水平降低。结论：(1)ADAM23在非小细胞肺癌中低表达,而αvβ3表达增高,二者可能在肺癌的侵袭和转移中发挥重要作用。(2)首次证实ADAM23基因在非小细胞肺癌中表达下调与启动子区异常甲基化修饰密切相关；推测甲基化修饰可能是导致该基因沉默的重要机制。(3)ADAM23可通过负调控整合素αvβ3从而促进肺癌的侵袭和转移。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
英文缩略词简表  11-15
第一部分 ADAM23、αvβ3在非小细胞肺癌中的表达及其与临床病理特征关系的研究  15-29
  前言  15-16
  1 材料与方法  16-22
    1.1 材料  16-18
      1.1.1 新鲜手术标本及临床资料  16
      1.1.2 主要试剂  16-17
      1.1.3 主要试剂盒  17
      1.1.4 主要抗体  17
      1.1.5 主要实验仪器设备  17
      1.1.6 主要溶液的配置  17-18
    1.2 方法  18-22
      1.2.1 技术路线  18-19
      1.2.2 免疫组织化学  19-20
      1.2.3.组织总RNA的提取、鉴定及RT-PCR  20-22
  2 结果  22-26
    2.1 肺癌组织、癌旁组织及肺良性病变组织中ADAM23和αvβ3蛋白的表达  22-24
    2.2 ADAM23、αv、β3基因mRNA在肺癌组织、癌旁组织及肺良性病变组织中的表达  24-25
    2.3 ADAM23、αvβ3蛋白表达与非小细胞肺癌临床病理特征间的关系  25-26
    2.4 非小细胞肺癌中ADAM23与αvβ3表达的关系  26
  3 讨论  26-28
  4 小结  28-29
第二部分 ADAM23在非小细胞肺癌中表达下调和其启动子区甲基化相关性的研究  29-47
  前言  29-30
  1 材料与方法  30-40
    1.1 材料  30-34
      1.1.1 新鲜手术标本及临床资料  30
      1.1.2 细胞  30
      1.1.3 主要试剂及试剂盒  30-31
      1.1.4 主要仪器设备  31-32
      1.1.5 主要试剂配备  32-34
    1.2 实验方法  34-40
      1.2.1 技术路线  34-35
      1.2.2 细胞复苏与培养  35
      1.2.3 细胞冻存  35
      1.2.4 蛋白质的提取及Western-blotting  35-37
      1.2.5 细胞RNA的提取及RT-PCR  37
      1.2.6 细胞及新鲜组织DNA的提取、甲基化修饰及MSP  37-39
      1.2.7 5-Aza-2’-Cd药物配置及对细胞的处理  39-40
      1.2.8 统计学分析  40
  2 结果  40-44
    2.1 非小细胞肺癌细胞系中ADAM23的表达情况  40-41
    2.2 非小细胞肺癌细胞系和新鲜组织标本中ADAM23启动子甲基化情况  41-43
    2.3 5-Aza-2’-Cd处理细胞SPC-A1,LTEP-a-2前后RT-PCR和甲基化特异性PCR结果的改变  43
    2.4 5-Aza-2’-Cd处理细胞SPC-A1,LTEP-a-2前后αv、β3 mRNA的改变  43-44
  3 讨论  44-46
  4 小结  46-47
结论  47-48
参考文献  48-51
综述  51-60
  参考文献  57-60
致谢  60-61
攻读学位期间获奖情况及主要研究成果  61

ADAM23在非小细胞肺癌中的表达与启动子甲基化相关性的研究

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