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豆梨组织培养过程中玻璃化形成机制及其恢复技术研究

作　者: 王宏伟
导　师: 常有宏
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: 豆梨组织培养玻璃化组织解剖结构生理生化 DNA甲基化
分类号: S661.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本文在建立了豆梨低玻璃化高效快繁技术的基础上,针对引起试管苗玻璃化的影响因素进行比较研究,从生理生化和分子角度分析豆梨试管苗玻璃化的形成机制,并对玻璃化苗恢复技术进行了研究。主要研究结果如下：1.建立豆梨低玻璃化高效快繁技术。以豆梨的茎段为外植体,研究6-BA、NAA、蔗糖、琼脂、活性炭等因素对豆梨试管苗的影响,分析了4种基本培养基(MS、AS、NN69、WPM),6-BA和NAA的不同浓度配比以及2种不同培养方式对豆梨增殖效果的影响,还比较了NAA和IBA这2种激素对豆梨生根的影响。结果表明：在豆梨组织培养过程中,高浓度6-BA对豆梨增殖系数和玻璃化现象均有明显的促进作用,活性炭对增殖系数、玻璃化率及苗高起到抑制作用,高浓度NAA直接促进茎的生长,以MS作为基本培养基,适宜增殖培养基为MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.2mg/L,适宜培养方式为增殖培养基与MS空白培养基上隔代交替培养,适宜生根培养基为1/2 MS +1.5mg/LIBA.2.研究了玻璃化试管苗的恢复技术。以正常增殖状态下产生的玻璃化苗(轻度和重度)为材料,采取不同措施对玻璃化苗进行恢复,并对玻璃化苗(轻度和重度)、恢复苗和正常苗在形态解剖学、生理生化、叶绿素荧光等方面进行比较研究。结果表明：对玻璃化苗(轻度和重度)进行适当的水分控制和紫外线照射均能使两种玻璃化苗有不同程度的恢复,其中将材料在无菌空三角瓶中封口放3天,使其适当失水后,再将材料转接到MS空白培养基中培养30天,最高恢复率可达100%。3.比较豆梨不同程度玻璃化苗和正常苗叶片超微结构、叶绿素荧光和抗氧化酶活性差异。结果表明：(1)豆梨玻璃化苗叶片气孔呈关闭状态,细胞器受到损伤,叶绿体数量减少,类囊体膜排列紊乱。(2)玻璃化叶片比正常叶片有较低的Fv/Fm, Fv/Fo, qP和PhiPS2,过剩的能量将在PSⅡ反应中心积累,产生大量ROS。(3)正常苗的SOD、CAT酶活性均高于玻璃化苗,并且玻璃化程度越重,活性越低；POD酶活性则呈相反趋势,表现为正常苗低于玻璃化苗。4.利用甲基化敏感扩增多态性(Methylation-ensitive amplification poly-morphism, MSAP)技术分析豆梨正常苗和玻璃化苗CCGG位点胞嘧啶甲基化模式和水平的差异。结果表明：玻璃化苗总基因组DNA甲基化比率为83.3%,低于正常苗(87.6%)。此外,玻璃化苗去甲基化位点与叶片等组织衰亡有关,在DNA水平上,可能是叶片等组织衰老发育相关区域甲基化状态的改变直接影响植株的发育。

全文目录

摘要 7-9ABSTRACT 9-11缩略语表 11-12前言 12-13第一章文献综述 13-27 1 梨组织培养的研究进展 13-14 2 植物试管苗玻璃化的研究进展 14-17 2.1 试管苗玻璃化现象发生的普遍性 14 2.2 玻璃化苗的形态解剖学特性研究 14-15 2.3 玻璃化苗的生理生化特性研究 15 2.4 影响试管苗玻璃化的因素 15-16 2.4.1 外植体 15-16 2.4.2 培养条件 16 2.4.3 培养基成分 16 2.4.4 琼脂 16 2.4.5 碳源和植物激素 16 2.5 玻璃化苗的发生机制 16-17 2.6 玻璃化苗的预防措施 17 3 玻璃化苗的恢复技术研究 17-18 4 MSAP技术的研究进展 18-20 4.1 MSAP技术的原理 18-19 4.2 MSAP在植物上的应用 19-20 参考文献 20-27第二章豆梨低玻璃化高效快繁技术研究 27-37 1 材料与方法 27-29 1.1 实验材料 27-28 1.2 实验方法 28-29 1.2.1 初代培养 28 1.2.2 影响豆梨试管苗的主要因素筛选 28 1.2.3 基本培养基对增殖的影响 28 1.2.4 不同培养方式对增殖的影响 28 1.2.5 生根培养基的筛选 28-29 1.3 数据处理 29 2 结果与分析 29-33 2.1 不同处理因素对豆梨试管苗增殖的影响 29-30 2.2 不同处理因素对豆梨试管苗玻璃化的影响 30-31 2.3 不同处理因素对豆梨试管苗苗高的影响 31 2.4 不同处理因素对豆梨试管苗叶片大小的影响 31-32 2.5 基本培养基对增殖的影响 32 2.6 不同培养方式对增殖的影响 32-33 2.7 生根培养 33 3 讨论 33-35 参考文献 35-37第三章豆梨玻璃化试管苗的恢复技术研究 37-45 1 材料与方法 37-39 1.1 实验材料 37-38 1.2 实验设计与方法 38-39 1.2.1 豆梨玻璃化苗的恢复措施 38 1.2.2 恢复苗与正常苗增殖差异比较 38 1.2.3 恢复苗与正常苗生根能力比较 38 1.2.4 恢复苗与正常苗生理指标比较 38-39 2 结果与分析 39-43 2.1 不同处理方法对玻璃化苗恢复率的影响 39-40 2.1.1 脱水对玻璃化苗恢复率的影响 39-40 2.1.2 紫外光线对玻璃化苗恢复率的影响 40 2.1.3 营养元素对玻璃化苗恢复率的影响 40 2.2 生理生化和形态解剖结构比较 40-43 2.2.1 恢复苗与正常苗增殖系数的比较 40-41 2.2.2 恢复苗与正常苗生根率的比较 41 2.2.3 恢复苗、玻璃化苗与正常苗叶绿素的比较 41-42 2.2.4 恢复苗、玻璃化苗与正常苗形态解剖学上的比较 42-43 3 讨论 43-44 参考文献 44-45第四章豆梨玻璃化苗与正常苗超微结构、叶绿素荧光及抗氧化酶活性比较研究 45-55 1 材料与方法 46-47 1.1 实验材料 46 1.2 实验方法 46-47 1.2.1 叶片相对含水量和叶绿素的测定 46-47 1.2.2 形态解剖结构观察 47 1.2.3 叶绿素荧光的测定 47 1.2.4 酶活性的测定 47 2 结果与分析 47-50 2.1 梨培养过程中不同时期玻璃化苗比例 47 2.2 叶片表面结构比较 47-48 2.3 超微结构比较 48-49 2.4 叶绿素和含水量的比较 49 2.5 叶绿素荧光的比较 49-50 2.6 酶活性的比较 50 3 讨论 50-51 4 结论 51-52 参考文献 52-55第五章豆梨玻璃化苗基因组DNA表观遗传变化的MSAP分析 55-65 1 材料与方法 56-58 1.1 实验材料 56 1.2 基因组DNA的提取与纯化 56 1.3 DNA甲基化的MSAP分析 56-58 1.3.1 DNA的酶切与连接 #44Table 5-1 Sequences of adaptors and primers for MSAP analysis 56-57 1.3.2 PCR扩增 #45进行预扩增和选择性扩增,方法参考潘雅姣等 57 1.3.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 57-58 1.3.4 银染 58 1.3.5 谱带统计 58 1.3.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳特异片段的回收 58 1.3.7 序列测定和分析 58 2 结果与分析 58-61 2.1 豆梨正常苗与玻璃化苗DNA甲基化的差异 58-59 2.2 豆梨玻璃化引起的甲基化状态变化 59-60 2.3 MSAP多态性差异片段的序列分析 60-61 3 讨论 61-62 参考文献 62-65全文结论 65-67创新点 67-69攻读硕士学位期间所发表论文 69-71致谢 71

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