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抗人B7-2人—鼠嵌合抗体的制备及抗肿瘤作用研究

作　者: 刘玉华
导　师: 邱玉华
学　校: 苏州大学
专　业: 免疫学
关键词: B7-2 嵌合抗体淋巴瘤凋亡 ADCC效应 CDC效应
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:制备抗人B7-2人-鼠嵌合抗体(命名为ch1D1)并研究其抗肿瘤作用。方法:1、嵌合抗体ch1D1的制备、纯化及效价鉴定将稳定分泌ch1D1的真核表达细胞株CHO-ch1D1,经G418(浓度为500～800mg/mL)加压筛选及亚克隆化培养后,挑选高表达株,无血清大批量培养,收集上清。应用Protein G亲和层析法分离纯化,紫外分光光度法定量。收集生长良好的B7-2基因转染细胞L929-B7-2,5×10~5/管/100μL,分别按4μg、2μg、1μg及0.5μg/管加入ch1D1,经间接免疫荧光及流式细胞术分析,以出现最高阳性率时的最小用量定为抗体的效价。2、嵌合抗体ch1D1对膜型B7-2分子的识别收集生长良好的Raji、Daudi(B系淋巴瘤细胞株)及Jurkat(T系淋巴瘤细胞株),1×105/管/100μL,分别加入ch1D1,1μg/管,间接免疫荧光及流式细胞术分析。同时以鼠源性的亲本抗体1D1作抗体对照,并以L929-B7-2为细胞株的阳性对照。3、嵌合抗体ch1D1对Raji细胞的生长抑制及诱导凋亡的作用研究将终浓度为10μg/mL ch1D1加入到Raji细胞中,共培养72h,MTT法检测细胞的增殖抑制效应。流式细胞术检测细胞的凋亡率。4、嵌合抗体ch1D1Fc段介导的ADCC及CDC效应分析取新鲜抗凝外周血,常规Ficoll分离法获外周血单个核细胞(PBMCs),以该细胞为效应细胞, Raji为靶细胞,加入终浓度为10mg/mL ch1D1,培养4h、24h、48h及72h,经MTT法分析ch1D1介导的杀伤效应。以人血清作为补体来源,同法分析ch1D1介导的CDC效应。5、嵌合抗体ch1D1对Raji细胞体内致瘤的抑制作用研究选择6周龄、雌性BALB/c裸鼠,随机分为三组,10只/组,A组:单纯接种Raji细胞,5×10~6/200μL/只;B组:Raji+ ch1D1;C组:Raji+1D1;接种部位为左腋皮下。运用抗体组者,先分别将ch1D1及1D1(50μg/200μL)加在Raji细胞中结合30min后接种。逐日观察肿瘤形成时间、成瘤率、肿瘤大小及裸鼠生存状态等。结果:1、ch1D1的表达与效价经Protein G亲和层析法分离纯化,从CHO培养上清中获取的目的抗体约为30mg/L。经流式细胞仪分析,该抗体用于间接免疫荧光分析的用量为1μg/5×105细胞。2、ch1D1对膜型B7-2分子的识别ch1D1与Raji、Daudi、Jurkat及L929-B7-2细胞的阳性结合率分别为97.5%、96.5%、2.1%及97.2%。与鼠源亲本抗体1D1的阳性结合率(分别为99.6%、98.4%、2.3%及99.9%)相当。3、ch1D1对Raji细胞的生长抑制及诱导凋亡的作用研究ch1D1对Raji细胞增殖的抑制率在二者共培养72h时达27.1%。与B7-1嵌合抗体ch4E5联合应用,抑制率可达56.3%,较ch1D1单独应用具有统计学差异(P<0.05)。ch1D1与Raji细胞共培养24h,细胞凋亡率为12.21%,与鼠源亲本抗体诱导的凋亡率(12.44%)相当。而联合B7-1嵌合抗体ch4E5,其诱导的凋亡率上升为22.75%。4、ch1D1Fc段介导的ADCC及CDC效应分析ch1D1介导PBMC对Raji细胞4h、24h、48h及72h的杀伤率分别为25.0%、52.0%、71.3%及72.7%;ch1D1介导补体对Raji细胞的杀伤率分别为39.4%、54.6%、60.3%及66.1%,与人IgG1及鼠源亲本抗体比较均明显升高(P<0.05)。5、ch1D1对Raji细胞体内致瘤的抑制作用研究Raji细胞经ch1D1处理后接种的裸鼠,在70天的观察期内均未见肿瘤形成,裸鼠存活状态良好。而单独接种Raji细胞组,第30天形成肉眼可见的肿瘤结节,成瘤率70%(7/10),肿瘤平均直径2.8mm,70天肿瘤直径达13.3mm。部分荷瘤鼠死亡。经鼠源亲本抗体处理组也未出现肿瘤结节。结论:本研究成功制备了B7-2人-鼠嵌合抗体,体内外研究结果均显示该抗体具有良好的抗肿瘤作用。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-8
研究背景  8-15
  1、B7 分子的结构、表达及介导的共刺激信号  8-9
  2、基因工程抗体的研究进展  9-10
  3、嵌合抗体在临床疾病治疗中的应用  10-12
  参考文献  12-15
第一部分抗人B7-2 人-鼠嵌合抗体的制备  15-20
  材料和方法  15-16
  结果  16-18
  讨论  18-19
  参考文献  19-20
第二部分抗人 B7-2 嵌合抗体抗肿瘤作用研究  20-31
  材料和方法  20-22
  结果  22-27
  讨论  27-29
  参考文献  29-31
全文小结  31-32
综述  32-40
  参考文献  37-40
硕士期间发表的论文  40-41
本研究所获的基金资助  41-42
缩略词表  42-43
致谢  43

抗人B7-2人—鼠嵌合抗体的制备及抗肿瘤作用研究

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