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抗人B7-1人—鼠嵌合抗体的制备及生物学功能研究

作　者: 王艳茹
导　师: 邱玉华
学　校: 苏州大学
专　业: 免疫学
关键词: B7-1 嵌合抗体 Fas/FasL ADCC效应 B淋巴瘤细胞
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:在本科室成功构建的抗人B7-1人-鼠嵌合抗体重组表达质粒pIRES/ch-4E5的基础上,将其转染CHO细胞,获得持续稳定分泌嵌合抗体的真核表达细胞株CHO-ch-4E5并制备嵌合抗体。进而分析抗体的生物学功能。方法:(1)采用小量质粒抽提试剂盒提取抗人B7-1人-鼠嵌合抗体的重组表达质粒pIRES/ch-4E5,经脂质体法转染CHO细胞,用G418选择培养基加压培养约2周,收集培养上清,经流式细胞术(FCM)进行检测。阳性孔细胞再经亚克隆筛选;(2)收集稳定分泌嵌合抗体的CHO细胞,采用Trizol法抽提总RNA,经RT-PCR方法合成cDNA,再加入特异性引物经PCR扩增嵌合重、轻链基因;(3)大规模无血清培养稳定分泌嵌合抗体的CHO细胞,收集上清,经高速离心、超滤浓缩及PBS透析过夜,采用Protein G亲和层析柱进行分离纯化,Lowry法定量,间接免疫荧光及FCM法分析抗体对Raji、Daudi、U937、K562、L929-B7-1及Jurkat等多种细胞表面膜型B7-1分子的结合;(4)将Raji和Daudi细胞与终浓度为10μg/ml的ch-4E5共培养,经FCM动态检测肿瘤细胞表面Fas及FasL的表达,MTT法分析ch-4E5对Raji和Daudi细胞体外增殖的抑制作用;(5)针对嵌合抗体的Fc段功能,以人外周血PBMC为效应细胞,以上述肿瘤细胞为靶细胞,按效靶比20:1混合细胞,加入终浓度10μg/ml的ch-4E5共培养,MTT法分析嵌合抗体介导的ADCC效应;(6)在上述体外研究的基础上,选取4～6周龄,雌性BALB/c裸鼠,随机分组,10只/组。按体重10 mg/kg的抗体量分别将抗体(ch-4E5、亲本4E5)与Raji细胞(5×10~6/只)混合于37℃、5%CO2培养箱中孵育30 min,按下列组别接种于裸鼠左前肢腋下。①组:Raji;②组:Raji+Hu-IgG1;③组:Raji+ch-4E5;④组:Raji+4E5。逐日观察并记录荷瘤裸鼠的生存状况、成瘤时间及成瘤率。结果:(1)成功获得了持续稳定分泌抗人B7-1人-鼠嵌合抗体的真核表达细胞株CHO-ch-4E5,PCR鉴定结果证实目的基因正确;(2)经Lowry法定量,从CHO-ch-4E5培养上清中获取嵌合抗体的量约30mg/L;(3) FCM分析表明,ch-4E5能够特异性结合多种细胞表面膜型B7-1分子,与Raji、Daudi、U937、K562、L929-B7-1及Jurkat细胞的阳性结合率分别为98.6%、96.4%、2.2%、29.6%、98.8%及10.1%,与亲本鼠源性抗体的结合率相当;(4)ch-4E5与肿瘤细胞共培养后,能够明显抑制Raji及Daudi细胞的体外增殖,抑制率分别为34.60%及32.64%,进一步的分析表明肿瘤细胞Fas及FasL的表达上调;(5) ch-4E5 Fc段介导PBMC对Raji及Daudi的杀伤率分别为55.61%及54.42%;(6)体内荷瘤实验的结果表明,Raji细胞经ch-4E5及4E5抗体处理的实验组均未见肿瘤形成,小鼠成活率为100%。而接种Raji及Raji+Hu-IgG1组一周后,裸鼠开始出现消瘦、活动减弱、食量减少、脊柱隆起等生长状态不佳的表现。至30天时,出现肉眼可见的肿瘤,90天时,成瘤率达80%,瘤体体积为(1404.70±47.23)mm~3,肿瘤生长速度为(15.53±0.58)mm~3/d。结论:本组自行研制的抗人B7-1人-鼠嵌合抗体具有生物学功能,对B7-1分子相关肿瘤的临床治疗具有潜在意义。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-9
研究背景  9-20
  1 B7分子的结构及表达  9-10
  2 B7分子介导的共刺激信号在免疫应答中的作用  10-11
  3 基因工程抗体及其在疾病治疗中的作用  11-16
  参考文献  16-20
第一部分抗人 B7-1 人-鼠嵌合抗体的制备  20-35
  材料和方法  21-26
  结果  26-32
  讨论  32-34
  参考文献  34-35
第二部分抗人 B7-1 人-鼠嵌合抗体生物学功能研究  35-47
  材料和方法  36-38
  结果  38-44
  讨论  44-46
  参考文献  46-47
小结与展望  47-49
研究生期间完成的论文  49-50
本研究所获的基金资助  50-51
附录一缩略词表  51-53
附录二综述  53-63
致谢  63-64

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