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蜜蜂丙糖磷酸异构酶基因的克隆分析及原核表达与纯化研究

作　者: 徐剑
导　师: 陆小平
学　校: 苏州大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 丙糖磷酸异构酶意大利蜜蜂基因克隆原核表达纯化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 74次
引　用: 2次
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内容摘要

蜜蜂是重要的经济昆虫,也是昆虫大量试验的模式材料。丙糖磷酸异构酶(Triosephosphate isomerase TPI or TIM,EC 5.3.1.1)是生物中广泛存在的一种糖酵解酶,存在于多种组织中,催化二羟丙酮磷酸与3-磷酸甘油醛之间的可逆反应,且在糖酵解、脂肪酸合成、糖原异生和戊糖磷酸途径中发挥着重要作用。为在分子水平上探明TPI的生物学功能,本文从意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)的肌肉组织中提取总RNA,设计特异引物,采用RT-PCR的方法克隆了蜜蜂第16号染色体上的丙糖磷酸异构酶(AMTPI)基因的cDNA序列。运用生物信息学的方法对蜜蜂丙糖磷酸异构酶基因及其编码蛋白序列进行了初步分析,得到了基因和蛋白质组学研究中一些有价值的参数。AMTPI具有多种二级结构形式,是典型的(α/β)8结构,在SWISS-MODEL服务器三维建模后,运用ViewerLite 5.0进行序列编辑,获得了AMTPI的三级结构模型。将测序结果(GenBank登录号EU76098)与GenBank中的其他物种进行同源性分析。多重比对显示AMTPI有多个保守结构,物种间的整体相似度较高,与家蚕、德国小镰、黄粉虫、丽蝇蛹集金小蜂、水稻等物种的基因相似性达69%以上,蛋白相似性达59%以上,用MEGA 4软件按Minimum Evolution方案进行分子系统演化分析,获得了TPI氨基酸序列的分子进化树,这为研究意大利蜜蜂的系统发生、遗传变异以及家系、亚家系的亲缘关系提供理论依据。将目的基因克隆到pGEX-4T-2原核表达载体上,并在大肠杆菌中得到了成功表达,4小时的表达量为总蛋白的42.1%。试验纯化了GST-AMTPI融合蛋白,并对产物进行了浓缩;为研究AMTPI在真核细胞中的表达,构建了真核表达载体,为进一步分析该酶的药理学活性提供参考。

全文目录

中文摘要  6-7
Abstract  7-9
前言  9-10
第一章文献综述  10-21
  1 蜜蜂基因组及功能基因的研究进展  10-13
    1.1 蜜蜂基因组测序  10-11
    1.2 蜜蜂基因组的特征  11
    1.3 蜜蜂基因组中的功能基因研究  11-13
      1.3.1 性别决定基因  11
      1.3.2 免疫通路和防御机制相关基因  11-12
      1.3.3 气味识别基因  12
      1.3.4 社会分工相关基因  12
      1.3.5 DNA 甲基化  12
      1.3.6 蜜蜂群体遗传学及进化研究  12
      1.3.7 王浆主蛋白基因  12-13
      1.3.8 级型分化相关基因  13
  2. 丙糖磷酸异构酶的研究进展  13-19
    2.1 TPI 的空间结构和催化机理  14-17
    2.2 TPI 的分子生物学和酶学研究  17-19
  3. 研究技术路线  19-21
第二章材料与方法  21-31
  1 材料与试剂  21-24
    1.1 菌株和质粒  21
    1.2 酶和试剂  21
    1.3 培养基  21
    1.4 碱性质粒抽提试剂  21-22
    1.5 核酸电泳的相关试剂  22
    1.6 SDS-PAGE 蛋白质电泳试剂的配制  22-23
    1.7 其他常用缓冲液和试剂  23-24
  2 实验常用仪器设备  24
  3 实验方法  24-31
    3.1 蜜蜂总 RNA 的提取  24-25
    3.2 RT-PCR 扩增蜜蜂TPI 基因片段  25
    3.3 PCR 产物的克隆  25-29
      3.3.1 PCR 产物的回收  25-27
      3.3.2 连接反应  27
      3.3.3 大肠杆菌E.coli TG1 感受态细胞制备  27-28
      3.3.4 连接产物的转化  28
      3.3.5 重组质粒的筛选  28-29
    3.4 琼脂糖凝胶电泳  29
    3.5 酶切目的片段回收  29
    3.6 SDS-PAGE 蛋白质电泳  29-30
    3.7 SDS-PAGE 凝胶的染色和脱色  30
    3.8 AMTPI 基因的生物信息学分析  30-31
第三章 AMTPI 基因的克隆和验证  31-35
  1. 材料和方法  31
    1.1 材料  31
    1.2 方法  31
      1.2.1 蜜蜂总 RNA 的提取  31
      1.2.2 引物设计和RT-PCR 扩增  31
  2. 结果与分析  31-33
  3. 讨论  33-35
第四章 AMTPI 基因及其编码蛋白质的生物信息学分析和分子进化研究  35-64
  1 AMTPI 基因开放阅读框的生物信息学分析  35-42
    1.1 AMTPI 基因开放阅读框的检索和序列分析  35-38
    1.2 基于NCBI/Blast 软件的AMTPI 基因的定位及同源性分析  38-42
  2 AMTPI 基因编码蛋白质的生物信息学分析  42-56
    2.1 AMTPI 编码氨基酸序列组成分析  42-44
    2.2 基于NCBI/Blast 软件的AMTPI 蛋白质同源性分析  44-47
    2.3 AMTPI 氨基酸特征位点分析  47-48
    2.4 AMTPI 编码蛋白序列的分子结构和理化性质分析  48-50
    2.5 AMTPI 编码蛋白序列的结构域预测和亚细胞定位分析  50-53
    2.6 AMTPI 蛋白质序列二、三级结构预测和分析  53-56
  3 构建基于TPI 氨基酸序列的分子进化树  56-62
  4 讨论  62-64
第五章 AMTPI 基因原核表达载体的构建、表达与纯化  64-72
  1. 材料和方法  64-66
    1.1 材料  64
    1.2 方法  64-66
      1.2.1 原核表达载体pGEX-4T-2-AMTPI 的构建  64
      1.2.2 重组质粒转化BL21  64
      1.2.3 菌体的诱导表达  64
      1.2.4 SDS-PAGE 电泳  64-65
      1.2.5 表达产物的纯化与浓缩  65-66
  2 结果与分析  66-71
    2.1 重组质粒pGEX-4T-2-AMTPI 的鉴定结果  66-67
    2.2 pGEX-4T-2-AMTPI 在大肠杆菌中的表达  67-69
    2.3 GST-AMTPI 融合蛋白的纯化与浓缩  69-71
  3 讨论  71-72
第六章 AMTPI 基因真核表达载体的构建  72-75
  1 材料和方法  72
    1.1 材料  72
    1.2 方法  72
    1.3 AMTPI 真核表达载体的构建  72
  2 结果  72-75
    2.1 pMD18-T/AMTPI 质粒PCR  72-73
    2.2 重组质粒pEGFP-C1/AMTPI PCR 鉴定与酶切鉴定  73-75
第七章结论  75-77
  1 小结  75-76
  2 创新  76
  3 尚待进一步研究的内容  76-77
参考文献  77-83
附录一测序报告  83-84
附录二中英文简写对照表  84-85
附录三提交GenBank 的AMTPI 序列（GenBank：EU760983.1）  85-86
附录四研究生在校期间发表的学术论文与研究成果  86-87
致谢  87

蜜蜂丙糖磷酸异构酶基因的克隆分析及原核表达与纯化研究

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