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Atg7及其参与的自噬在热致小鼠生精障碍中的作用

作　者: 张媔秋
导　师: 祝辉；沙家豪；周作民
学　校: 南京医科大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 生精细胞凋亡自噬 Atg7 睾丸加热小鼠
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

睾丸局部温和的热刺激可引起可逆的生精障碍,以往研究表明热作用可能是通过引起生精细胞凋亡而致生精破坏。近年来研究发现,在体细胞中热作用也可以诱导自噬的发生。自噬是一个降解坏死细胞器及变性蛋白质的过程,在促进细胞存活,维持细胞内稳态,保持细胞健康过程中起着重要作用。同时自噬也可以引起细胞死亡,称为自噬性细胞死亡,是程序性细胞死亡的一种。在细胞死亡的过程中自噬与凋亡的关系非常复杂,目前尚未能完全阐明。自噬在生精细胞中的发生及作用目前尚没有报道。本研究试图揭示热作用是否也诱导生精细胞中自噬的发生,以及这个过程是否参与了热所致的生精破坏过程。对上述问题的阐述能帮助我们进一步理解精子发生的分子调控机制。我们运用小鼠作为研究模型,分别从体内和体外实验两方面进行了研究。首先探讨热作用后生精细胞的自噬和凋亡状态。我们构建了小鼠睾丸局部受热模型,将小鼠行睾丸局部42℃的水浴受热15分钟,受热后恢复的不同时间点进行细胞凋亡和自噬水平检测,结果显示:受热后12小时,生精细胞的凋亡和自噬水平均显著增加。另一方面,我们对小鼠精母细胞系(GC2-spd细胞)行42℃孵育受热3小时,构建了体外生精细胞受热模型,结果显示热作用后GC2-spd细胞的自噬和凋亡水平也显著升高。上述结果提示热作用能诱导生精细胞发生凋亡和自噬。进一步我们试图揭示经典的泛素样蛋白通路(ubiquitin-like conjugation pathway)是否参与热所致的小鼠生精细胞自噬过程,从以下三个方面进行了研究:(1)检测参与泛素样蛋白通路的相关基因/蛋白在小鼠睾丸中的表达情况。ATG(Autophagy-related)基因是最先在酵母鉴定出的一组自噬相关基因,其中Atg12-Atg5和Atg8(LC3)-PE(磷脂酰乙醇胺)是介导自噬泡正常形成的两条泛素样蛋白通路,本研究运用RT-PCR手段从mRNA水平证实这两条通路中所有基因在小鼠睾丸均有表达;而Western Blot检测显示通路中的关键上游蛋白Atg7在间质细胞,支持细胞以及各级生精细胞中均有表达。上述结果提示泛素样蛋白通路可能在热作用诱导的生精细胞自噬过程中发挥作用。(2)选取泛素样蛋白通路中的关键蛋白Atg7作为研究靶点,检测该蛋白的表达是否与热所致的生精细胞自噬相关。结果显示:睾丸局部受热及体外精母细胞系受热后,Atg7的表达水平升高,并在受热后12小时达到高峰,这与受热后自噬水平增加的趋势相一致。提示Atg7及其参与的泛素样蛋白通路可能参与了热作用诱导的生精细胞自噬过程。(3)通过干涉Atg7的表达抑制泛素样蛋白通路的作用,检测其对热诱导自噬的影响。我们用RNAi的手段分别在小鼠睾丸和GC2-spd细胞中抑制了Atg7的表达,结果发现Atg7表达下调后能显著降低热所致的生精细胞的自噬水平。这一结果更直接地揭示Atg7及其参与的泛素样蛋白通路介导了热作用诱导的生精细胞自噬。最后我们探讨了Atg7及其参与的自噬在热致生精障碍中的作用。在小鼠睾丸和GC2-spd细胞中用RNAi的手段抑制Atg7的表达,加热后分别用TUNEL及流式细胞术检测细胞凋亡水平。结果显示:当Atg7表达下调而抑制了自噬的发生后,生精细胞的凋亡也显著下降。这一结果提示,热作用后,Atg7及其参与的自噬可能参与到生精细胞的凋亡进程,共同引起生精障碍。综上所述,本研究证实热作用可以诱导小鼠生精细胞发生凋亡和自噬,这两者可能以协同作用参与到细胞死亡进程中,从而引起生精障碍。而Atg7及其参与的泛素样蛋白通路可能是热诱导自噬发生的主要通路。

Atg7及其参与的自噬在热致小鼠生精障碍中的作用

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