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猪链球菌2型感染小鼠腹腔巨噬细胞基因表达谱差异分析
作 者: 荣杰
导 师: 姚火春
学 校: 南京农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 猪链球菌2型 小鼠全基因组芯片 差异表达基因 Gene ontology Pathway Signal-net
分类号: S858.91
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2, SS2)为革兰氏阳性球菌,是一种重要的猪病病原菌,不仅可以引起败血病,也可以侵害中枢神经系统和其他组织,引发脑膜炎、心内膜炎、肺炎和关节炎。此外,SS2还可以通过人皮肤表面伤口感染引发人猪链球菌病。SS2的致病机制尚不明确,动物模型是研究其致病机理必不可少的。一直以来,小鼠就是评价猪链球菌毒力的动物模型。业已证明与C57BL/6(B6)小鼠相比,A/J小鼠对SS2的感染更敏感。为了阐明小鼠对SS2感染的敏感性差异的基因基础,本研究做了以下工作。通过小鼠全基因组芯片杂交检测,鉴定感染SS2小鼠腹腔巨噬细胞基因表达的改变以及A/J和B6小鼠基因表达的差异。结果显示A/J和B6两品系小鼠感染组之间的差异表达基因为6023个,其中上调基因3273个,下调基因1750个;A/J和B6两品系小鼠对照组之间的差异表达基因为3044个,其中上调基因2014个,下调基因1030个;A/J小鼠感染前后差异表达基因有2646个,其中上调基因1469个,下调基因1177个;B6小鼠感染前后差异表达基因有1449个,其中上调基因778个,下调基因671个;两品系差异表达基因的交集个数为597个,A/J小鼠特异的差异表达基因为2049个,B6小鼠特异的差异表达基因为852个。分别从A/J和B6小鼠感染前后差异表达基因中挑选20个相同基因,设计引物,对芯片结果进行RT-PCR验证,均有有16个基因与芯片结果相符。在感染SS2后,A/J和B6小鼠的Toll样受体2基因(Tlr2)、肿瘤坏死因子基因(Tnf)、基质金属蛋白酶9基因(Mmp9)和正聚蛋白3基因(Ptx3)的表达均上调,但后三个基因在两个小鼠品系身上的表达存在显著性差异,且这四个基因在之前的猪链球菌感染的报告中均有出现。该检测产生了一群与A/J和B6小鼠对SS2感染存在敏感性差异相关的候选基因,这些结果SS2感染的致病机理及抗病育种提供一定的理论依据。为了分析SS2感染小鼠差异表达基因的功能和特性,本研究对这些基因进行了Gene Ontology、Pathway、Path-net以及Signal-net等生物信息学分析。结果表明A/J和B6小鼠上调表达基因主要参与免疫应答、炎症反应、防御反应、B细胞受体信号途径以及Ⅰ型干扰素生物合成等;下调表达基因主要参与糖酵解、碳水化合物代谢过程、氨基酸代谢、行为和肌肉运动等。此外,B6小鼠感染SS2后的上调表达基因还参与了外源性抗原的处理和递呈、肽抗原的稳定、抗原受体介导信号途径、吞噬作用的正调节和单核淋巴细胞的分化调节等。此外,本试验研究了小鼠巨噬细胞吞噬SS2的能力,并用RT-PCR技术检测了小鼠巨噬细胞感染SS2后相关基因的表达变化。用SS2HA9801菌株感染Ana-1(小鼠巨噬细胞系)细胞,在1h、2h和4h时裂解细胞,释放胞内菌,平板计数细菌数。结果显示Anna-1细胞吞噬HA9801荚膜株的吞噬指数为2‰,被Ana-1细胞摄入到胞内的细菌在4h内被彻底清除。用HA9801菌株感染巨噬细胞,分别在0.5h、1h和2h时裂解细胞,提取细胞总RNA, real-time PCR检测细胞相关基因的表达变化。结果显示用HA9801菌株感染Ana-1细胞后,在0.5h时Tlr2、Tnf和Mmp9的表达没有明显变化,但随着时间的增长,三个基因的表达都有所增加,且Tnf上调倍数最高,Tlr2次之,Mmp9上调倍数最低。这些结果表明小鼠巨噬细胞对SS2荚膜菌株HA9801的吞噬能力有限,Tlr2、Tnf和Mmp9参与了巨噬细胞与SS2之间的相互作用。
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全文目录
摘要 7-9ABSTRACT 9-11第一篇 文献综述 11-33 第一章 猪链球菌病及猪链球菌2型研究进展 11-27 1 前言 11 2 病原及血清型 11-12 3 流行病学 12 4 毒力因子 12-16 4.1 荚膜多糖 12-13 4.2 溶菌酶释放蛋白(MRP)和胞外因子(EF) 13 4.3 溶血素 13-14 4.4 黏附素 14 4.5 纤连蛋白结合蛋白(fironectin-binding protein) 14-15 4.6 谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH) 15 4.7 SalK-SalR 15 4.8 Sortase 15-16 4.9 SAO 16 5 致病机理 16-17 6 诊断与治疗 17 7 小鼠动物模型 17-19 参考文献 19-27 第二章 基因芯片技术 27-33 1 基因芯片技术的背景 27 2 基因芯片的工作原理 27 3 基因芯片的技术流程 27-29 3.1 芯片的制备 27-28 3.2 探针标记与杂交 28-29 3.3 信号检测与结果分析 29 4 基因芯片的应用 29-31 4.1 基因表达分析 29-30 4.2 基因表达图谱的绘制 30 4.3 突变和多态性分析 30 4.4 杂交测序 30-31 参考文献 31-33第二篇 实验部分 33-77 第一章 猪链球菌2型感染小鼠腹腔巨噬细胞基因表达谱差异分析 33-51 1 材料与方法 34-40 1.1 菌株与培养条件 34 1.2 试验动物 34 1.3 试剂与仪器 34 1.4 细菌的培养 34 1.5 HA9801株感染A/J小鼠的半数致死量(LD50)的测定 34-35 1.6 HA9801株感染A/J和B6小鼠 35 1.7 腹腔巨噬细胞的制备 35 1.8 RNA的制备 35-36 1.9 芯片杂交与数据分析 36-37 1.10 荧光定量PCR验证 37-40 2 结果与分析 40-45 2.1 攻毒菌株的活菌计数 40 2.2 LD50的测定 40 2.3 小鼠攻毒后临床检验 40-41 2.4 RNA样品质量控制 41 2.5 差异表达基因的筛选 41-42 2.6 real-time PCR验证 42-44 2.7 基因表达水平比较 44-45 3 讨论 45-47 参考文献 47-51 第二章 两个品系小鼠差异表达基因的生物信息学分析 51-67 1 材料与方法 51-53 1.1 差异基因 51 1.2 分析方案 51-53 2 结果与分析 53-62 2.1 差异基因的显著性功能分析 53-54 2.2 差异基因的显著性pathway 54-56 2.3 显著pathway间作用网络 56-58 2.4 基因间作用网络 58-62 3 讨论 62-64 参考文献 64-67 第三章 小鼠巨噬细胞吞噬及清除SS2能力的研究 67-77 1 材料与方法 67-69 1.1 菌株与培养条件 67 1.2 细胞与培养条件 67-68 1.3 细菌的培养 68 1.4 Ana-1细胞吞噬试验 68 1.5 Ana-1细胞感染 68 1.6 总RNA的提取 68-69 1.7 总RNA的质量控制 69 1.8 RT-PCR鉴定相关基因的表达 69 2 结果与分析 69-71 2.1 Ana-1细胞对HA9801菌株的吞噬活化能力 69 2.2 Ana-1细胞总RAN质检结果 69-70 2.3 Ana-1细胞感染相关基因的表达研究 70-71 3 讨论 71-73 参考文献 73-77全文总结 77-79致谢 79
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 野生动物疾病 > 实验用动物
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