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地高辛对人恶性淋巴瘤细胞增殖、凋亡的影响及其分子机制的研究

作　者: 张文婷
导　师: 江莲
学　校: 河北医科大学
专　业: 儿科学
关键词: 地高辛 Raji细胞 Jurkat细胞细胞周期凋亡 Survivin Caspase-3 CyclinA
分类号: R965
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:恶性淋巴瘤(malignant lymphoma, ML)是原发于淋巴结和(或)结外淋巴组织的恶性肿瘤,为儿童时期最常见的恶性肿瘤之一,并且近年来其发病率呈逐年上升趋势,严重威胁着儿童的健康与生命,其确切病因不明。目前联合化疗仍是治疗恶性淋巴瘤的主要手段,但化疗的毒副作用以及多药耐药是影响患儿长期生存的重要因素之一。因此,寻求一种更为安全有效的药物,对改善患儿的预后和生活质量具有十分重要的意义。Survivin是近年来新发现的凋亡蛋白抑制剂(Inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族中的成员之一,具有抑制细胞凋亡、调节细胞周期和细胞分裂的功能。Caspase-3是调控细胞凋亡的核心因子,大多数触发细胞凋亡的因素,最终都是通过Caspase-3介导的信号传导途径起作用。Survivin可通过抑制Caspase-3活化,抑制细胞的凋亡。CyclinA是一种细胞周期的正性调控因子,其与相应的细胞周期依赖性激酶(Cyclin-dependent kinase, CDK)结合,是细胞越过R点并顺利完成S期、G2/M期所必需的因子。有研究证明强心甾(Cardenolide)具有抗肿瘤作用,其作用机制涉及抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞分化、凋亡等方面。地高辛(Digoxin)是一种临床上常用的强心甾类药物,目前有关地高辛对恶性淋巴瘤细胞的作用及其分子机制的研究报道罕见。本实验通过体外培养人Burkitt’s淋巴瘤Raji细胞、T细胞淋巴瘤Jurkat细胞,观察地高辛对Raji细胞、Jurkat细胞增殖、凋亡及细胞周期分布的影响,并检测Survivin、Caspase-3、CyclinA mRNA在细胞中的表达情况,初步探讨强心甾类药物地高辛对恶性淋巴瘤细胞的作用,并通过研究地高辛对Survivin、Caspase-3、CyclinA的影响进而研究其发挥抗肿瘤作用可能的分子机制,为地高辛抗肿瘤的临床应用提供理论依据。方法:体外培养人Burkitt’s淋巴瘤Raji细胞、T细胞淋巴瘤Jurkat细胞,用不同浓度的地高辛进行干预。应用MTT比色法检测细胞生长情况;流式细胞术(FCM)分析地高辛对细胞周期的影响并检测细胞凋亡的情况;应用RT-PCR法检测细胞中Survivin、Caspase-3、CyclinA mRNA的表达水平。计量资料采用均数±标准差(X±S)表示,实验数据用SPSS13.0软件进行统计学分析。各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),各组间两两比较采用SNK法(Student-Newman-Keuls),检验水平α=0.05,P<0.05视为差异有统计学意义。结果:1. MTT比色试验结果显示:25nmol/L,50nmol/L,100nmol/L,200nmol/L浓度地高辛作用于Raji细胞、Jurkat细胞24,48,72h后,与对照组相比,各实验组吸光度值(OD)均有不同程度的下降。除25nmol/L地高辛作用Raji细胞24h后吸光度值与对照组相比无统计学差异(P>0.05),余各实验组与对照组相比均有统计学差异(P<0.05)。除25nmol/L与50nmol/L地高辛作用于Jurkat细胞24h后吸光度值变化无统计学差异(P>0.05),余各浓度组之间吸光度值也存在统计学差异(P<0.05),且24, 48,72h时间组吸光度值有统计学差异(P<0.05)。即在一定浓度范围内,地高辛随着作用浓度及时间的增加,对Raji细胞、Jurkat细胞有不同程度的增殖抑制作用。2.流式细胞术检测结果显示:50nmol/L,100nmol/L,200nmol/L地高辛作用于Raji细胞、Jurkat细胞48h后,各实验组细胞周期分布发生变化,G2/M期细胞数增加,G0/G1期和S期细胞数减少。实验组Raji细胞、Jurkat细胞G2/M期细胞数与对照组相比有统计学差异(P<0.05),且各浓度组之间G2/M期细胞数有统计学差异(P<0.05)。3.流式细胞术检测结果显示:50nmol/L,100nmol/L,200nmol/L地高辛作用于Raji细胞、Jurkat细胞48h后,出现明显的凋亡峰,对照组未见凋亡峰或仅有低平的凋亡峰。经单因素方差分析,各浓度组地高辛作用Raji细胞、Jurkat细胞48h后的细胞凋亡率与对照组相比具有统计学差异(P<0.05),各浓度组之间地高辛对细胞凋亡率的影响有统计学差异(P<0.05)。4. RT-PCR检测结果显示:50nmol/L,100nmol/L,200nmol/L浓度地高辛作用于Raji细胞、Jurkat细胞48h后,Survivin、CyclinA mRNA的相对表达量均低于对照组,具有统计学差异(P<0.05),并随作用浓度增加相对表达量降低,同时Caspase-3 mRNA的相对表达量高于对照组,具有统计学差异(P<0.05),并随作用浓度增加相对表达量增高。且各浓度组之间Survivin、CyclinA、Caspase-3 mRNA相对表达量具有统计学差异(P<0.05)。结论:1.强心甾类药物地高辛体外对T、B淋巴瘤细胞(Raji细胞、Jurkat细胞)生长具有明显的抑制作用,且在50-200 nmol/L范围内呈时间、剂量依赖性。2.地高辛可使Raji和Jurkat细胞G2/M期细胞数增多,G0/G1和S期细胞数减少。细胞G2/M期阻滞可能与CyclinA基因表达受抑有关。通过阻滞细胞于G2/M期,抑制Raji和Jurkat细胞的增殖,此可能为地高辛抗肿瘤的作用机制之一。3.地高辛能够诱导淋巴瘤Raji细胞、Jurkat细胞凋亡,并可使Raji细胞、Jurkat细胞中Survivin mRNA的表达减少,Caspase-3 mRNA的表达增加,并呈明显的剂量依赖关系,认为地高辛诱导Raji细胞、Jurkat细胞凋亡的作用部分是通过下调Survivin的表达进而激活Caspase-3来实现的,这可能是地高辛抗肿瘤的又一重要机制。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-10
前言  10-11
材料与方法  11-17
结果  17-19
附图  19-28
附表  28-32
讨论  32-38
结论  38-39
参考文献  39-42
综述  42-56
  参考文献  50-56
致谢  56-57
个人简历  57

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