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CD59 CD55脂筏效应在T细胞活化信号转导中的作用研究

作　者: 聊菲
导　师: 高美华
学　校: 青岛大学
专　业: 免疫学
关键词: CD59 CD55 Jurkat细胞 T信号转导协同效应
分类号: R392.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：本研究采用siRNA技术,构建pSUPER-siCD55, pSUPER-siCD59重组载体,分别转染Jurkat细胞系,观测CD55和CD59特异性沉默对T细胞信号转导的影响,旨在探讨CD59与CD55锚固蛋白在脂筏中的协同效应。方法：构建pSUPER-siCD55 pSUPER-siCD59重组载体,利用PCR、质粒双酶切及DNA测序对其进行鉴定。阳离子脂质体法分别将pSUPER空质粒(Ⅱ组)、重组质粒pSUPER-siCD59(Ⅲ组)和pSUPER-siCD55(Ⅳ组)转染Jurkat细胞,G418筛选稳定表达细胞克隆。RT-PCR方法检测未转染的Jurkat细胞(Ⅰ组)、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组细胞中CD55和CD59基因mRNA的表达。用CD59币和CD55单克隆抗体联合作用各组T细胞,MTT法(淋巴细胞转化试验)测T细胞增殖、Western Blot测Src家族酪氨酸激酶(Src PTK)磷酸化的水平、激光共聚焦显微镜检测Fluo-3/Am负载的T细胞胞浆内钙离子的变化。结果：重组载体pSUPER-siCD55、pSUPER-siCD59经PCR及限制性内切酶酶切及测序鉴定,结果表明序列正确。重组质粒pSUPER-siCD59和pSUPER-siCD55分别转染Jurkat细胞,可表达绿色荧光蛋白,经G418筛选,得到阳性细胞克隆; RT-PCR结果显示,与Ⅰ、Ⅱ组比较,Ⅲ组细胞CD59和Ⅳ组细胞CD55 mRNA的表达均被明显抑制(P<0.05)。CD59mAb和CD55mAb联合作用于T细胞,Ⅰ组细胞增殖能力,Src家族酪氨酸激酶(Src PTK)瞵酸化条带的灰度值和细胞浆内[Ca2]i均明显高于Ⅲ、Ⅳ组(P<0.05),其中Ⅱ组低于Ⅲ组(P<0.05),差异有显著性,但Ⅰ、Ⅱ组间比较(P>0.05),无明显差异。结论：重组载体pSUPER-siCD59和pSUPER-siCD55可以分别特异性沉默CD59基因和CD55基因。本研究证实在CD59和CD55共同作用下,Jurkat细胞增殖、Src磷酸化和诱导产生[Ca2]i的能力均显著增强,其中CD59的作用更为显著。由此说明CD59、CD55锚固蛋白的脂筏效应在T细胞信号转导过程中存在协同作用。该研究为GPI锚固蛋白参与T细胞活化信号转导的分子机制提供了新的思路。为T细胞白血病的基因靶向治疗开辟了一条新途径,具有重要理论意义及临床应用前景。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-6
引言  6-9
技术路线  9-10
第一章材料和方法  10-21
  1.1 材料  10-11
    1.1.1 主要仪器设备  10
    1.1.2 质粒、菌株与细胞株  10
    1.1.3 主要实验试剂  10-11
  1.2 方法  11-21
    1.2.1. pSUPER-siCD55重组载体的构建与鉴定  11-16
      1.2.1.1 pSUPER载体的选择  11-12
      1.2.1.2 编码CD55 siRNA寡核苷酸序列的设计与合成  12
      1.2.1.3 寡核苷酸链的退火  12
      1.2.1.4 pSUPER空质粒的双酶切  12-13
      1.2.1.5 琼脂糖电泳  13
      1.2.1.6 酶切产物大分子片段的回收  13-14
      1.2.1.7 寡核苷酸链和线性载体的连接  14
      1.2.1.8 重组质粒pSUPER-siCD55转化E.coli.JM109  14
      1.2.1.9 菌液PCR检测重组质粒  14-15
      1.2.1.10 菌种的保存及复苏  15
      1.2.1.11 碱裂解法提取转化菌质粒  15-16
      1.2.1.12 质粒双酶切和测序鉴定  16
    1.2.2. pSUPER-siCD59重组质粒的扩增和鉴定  16
      1.2.2.1 重组质粒pSUPER-siCD59转化E.coli.JM109  16
      1.2.2.2 质粒小提  16
      1.2.2.3 酶切产物电泳鉴定  16
    1.2.3. pSUPER-siCD55和pSUPER-siCD59分别稳定转染Jurakt细胞系  16-18
      1.2.3.1 Jurakt细胞的复苏和培养  16-17
      1.2.3.2 细胞计数  17
      1.2.3.3 重组质粒的稳定转染  17
      1.2.3.4 RT-PCR检测CD55和CD59mRNA表达  17-18
    1.2.4. MTT法测Jurakt细胞增殖  18-19
    1.2.5. 激光共聚焦显微镜测细胞内钙离子浓度  19
    1.2.6. Western blot检测Src家族酪氨酸激酶(Src PTK)磷酸化  19-20
    1.2.7. 统计学方法  20-21
第二章结果  21-29
  2.1. pSUPER-siCD55重组载体的鉴定  21-22
    2.1.1 菌液PCR检测  21
    2.1.2 双酶切鉴定  21
    2.1.3 DNA序列鉴定  21-22
  2.2. pSUPER-siCD59重组质粒的酶切鉴定  22
  2.3. 重组质粒转染Jurakt细胞的筛选和鉴定  22-25
    2.3.1 细胞培养结果  22-23
    2.3.2 转染效率的测定  23-24
    2.3.3 RT-PCR检测  24-25
  2.4. MTT结果  25-26
  2.5. 细胞[Ca~(2+)]i结果  26-27
  2.6. Src PTK磷酸化结果  27-29
第三章讨论  29-33
结论  33-34
参考文献  34-36
综述  36-48
  参考文献  44-48
硕士研究生期间发表的文章  48-49
附录  49-57
致谢  57-58

CD59 CD55脂筏效应在T细胞活化信号转导中的作用研究

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