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负载口蹄疫病毒VP1抗原的树突状细胞启动的T细胞应答

作　者: 张雷
导　师: 王家鑫
学　校: 河北农业大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 口蹄疫病毒 VP1 原核表达 树突状细胞 T淋巴细胞
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(FMD virus, FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、高度接触性、发热性传染病。FMDV衣壳由4种结构蛋白VP1,VP2, VP3, VP4各60个拷贝组成。研究表明,结构蛋白VP1富含T细胞抗原表位与B细胞抗原表位,是诱导产生中和抗体的主要成分,同时还是被宿主细胞识别的主要病原体相关模式分子,在免疫应答中发挥着主要作用。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是功能最强大的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC),通过其吞噬受体或模式识别受体捕获抗原,并将其提呈给T细胞,它能够调节机体对病原体的免疫应答,但目前还不清楚它在抗FMDV感染中的作用。实验证明,FMDV野毒株并不感染DC,但在培养基上驯化的FMDV则可以感染DC,并且与抗体结合后的FMDV也可感染DC,导致其抗原提呈功能丧失,而当DC负载灭活FMDV免疫复合物后却能够有效地刺激T细胞。众所周知,细胞免疫应答在抗病毒感染过程中发挥重要作用。被DC活化的T细胞在IL-12的作用下,可分化为Th1细胞,介导细胞免疫应答并产生调理性抗体(IgG),从而清除胞内病原体感染。而在IL-4的作用下,有利于Th细胞向Th2细胞分化,介导体液免疫应答,产生中和抗体,清除外周循环中的病原体。目前尚不清楚DC启动细胞免疫应答的机制。本研究选用VP1进行原核表达,用纯化后的VP1负载DC,再与淋巴结T细胞进行共培养,通过ELISA检测共培养物上清中IFN-y和IL-4的水平,从而研究其免疫应答机制以及DC提呈FMDVVP1抗原的途径。试验以重组质粒pUC57-VP1为模板,经过Nco I-HF和Xho I双酶切得到FMDV的VP1基因,再以相同的限制性酶对原核表达载体pET32a(+)进行消化,通过T4 DNA连接酶连接二者,并将连接产物转化到宿主菌DH5a中去,得到重组质粒pET32a(+)-VP1,再将新得到的重组质粒pET32a(+)-VP1转化到宿主菌BL21(DE3)中去,经酶切鉴定以及基因序列测定。结果表明,VP1基因定向连接到原核表达载体pET32a(+)上。将VP1基因与GenBank发表的序列进行同源性比较,证明本研究所用的基因序列与Foot-and-mouth disease virus O isolate O/NYOO基因编码序列(NCBI登陆号为AY333431.1)同源性最高,可达100%。结果证明pET32a(+)-VP1重组表达菌构建成功。为鉴定pET32a(+)-VP1基因能否在大肠杆菌中进行表达,研究者对重组表达菌进行诱导表达,同时以相同的条件对空载体pET32a(+)进行诱导表达,用来作为阴性对照。SDS-PAGE电泳以及Western-blotting检测结果显示,在分子量约为43kDa处有一条明显的蛋白条带,而空载体pET32a(+)在相应的位置却未见此特异性蛋白条带。为了验证负载FMDV VP1的DC能否有效地激活淋巴结T细胞,用负载FMDVVP1的DC与淋巴结T细胞组成共培养体系,同时以DC与淋巴结T细胞共培养体系作为阴性对照,以DC作为空对照,通过ELISA检测不同时间点上清液中IFN-y和IL-4的水平。结果显示,负载FMDV VP1的DC能够有效地激活淋巴结T细胞。该结果为进一步研究DC提呈FMDVVP1的机制和新型疫苗的研制奠定了重要基础。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-7
缩略词索引表  7-11
1 引言  11-22
  1.1 口蹄疫的研究进展  11-14
    1.1.1 FMDV的生物学特性  12-13
    1.1.2 FMD的流行病学  13
    1.1.3 FMDV的感染机制  13-14
  1.2 树突状细胞的研究进展  14-18
    1.2.1 DC的起源和分类  14-15
    1.2.2 DC的生物学特性  15
    1.2.3 DC的抗原提呈途径  15-17
    1.2.4 DC与FMDV的关系  17-18
  1.3 T细胞介导的细胞免疫应答  18-19
    1.3.1 CD4~+T细胞介导的免疫应答  18
    1.3.2 CD8~+T细胞介导的免疫应答  18-19
    1.3.3 细胞免疫应答的基本过程  19
  1.4 T细胞应答的生物学作用  19-20
  1.5 本研究的目的和意义  20-22
2 实验材料、仪器及试剂  22-29
  2.1 菌株、载体和细胞  22
  2.2 主要实验材料  22-23
  2.3 主要仪器设备  23
  2.4 主要试剂配制  23-29
3. 实验方法  29-42
  3.1 重组质粒pET32a(+)-VP1的构建  29-33
    3.1.1 重组质粒pUC57-VP1的小量制备  29-30
    3.1.2 重组质粒pUC57-VP1的酶切鉴定  30
    3.1.3 目的基因VP1的回收  30-31
    3.1.4 原核表达载体pET32a(+)的制备  31
    3.1.5 原核表达载体pET32a(+)质粒的酶切鉴定  31
    3.1.6 目的基因pET32a(+)的回收  31
    3.1.7 VP1与pET32a(+)的定向连接  31-32
    3.1.8 连接产物转化感受态细胞DH5a  32-33
    3.1.9 重组质粒的酶切鉴定  33
  3.2 重组质粒pET32a(+)-VP1的DNA序列测定  33
  3.3 重组质粒pET32a(+)-VP1转化感受态细胞BL21(DE3)  33-34
    3.3.1 重组质粒pET32a(+)-VP1和pET32a(+)质粒转化感受态细胞BL21(DE3)  33
    3.3.2 转化质粒pET32a(+)-VP1和pET32a(+)的酶切鉴定  33-34
  3.4 转化BL21(DE3)的重组质粒pET32a(+)-VP1的DNA序列测定  34
  3.5 重组菌pET32a(+)-VP1的诱导表达  34-35
    3.5.1 重组表达菌的诱导表达  34
    3.5.2 重组蛋白最佳诱导表达条件的确定  34-35
    3.5.3 表达蛋白的可溶性检测  35
  3.6 重组蛋白的纯化回收  35-38
    3.6.1 包涵体的分离  35
    3.6.2 包涵体的洗涤  35-36
    3.6.3 包涵体的溶解  36
    3.6.4 包涵体的梯度透析复性  36
    3.6.5 SDS-PAGE  36-37
    3.6.6 电洗脱以及蛋白质的浓缩  37-38
    3.6.7 蛋白质浓度的测定及保存  38
  3.7 重组蛋白的western blot鉴定  38
  3.8 实验动物  38-39
  3.9 细胞培养  39-40
    3.9.1 骨髓源树突状细胞的制备  39
    3.9.2 小鼠淋巴结T细胞的制备  39-40
  3.10 负载FMDV VP1的DC激活淋巴结T细胞的检测  40-41
    3.10.1 负载VP1的BMDC与淋巴结T细胞共培养  40
    3.10.2 共培养上清中IFN-γ和IL-4的检测  40-41
  3.11 统计学分析  41-42
4 结果  42-55
  4.1 重组质粒pUC57-VP1的酶切鉴定  42
  4.2 重组质粒pET32a(+)-VP1的构建  42-43
  4.3 重组质粒pET32a(+)-VP1的序列测定  43-44
  4.4 重组表达质粒pET32a(+)-VP1的测序鉴定结果  44
  4.5 重组表达菌的诱导表达和SDS-PAGE分析  44-45
  4.6 重组蛋白最佳诱导条件的确定  45-47
    4.6.1 最佳诱导时间的确定  45
    4.6.2 最佳诱导温度的确定  45-46
    4.6.3 最佳诱导剂浓度的确定  46-47
  4.7 重组蛋白的超声波裂解  47-48
  4.8 重组蛋白的纯化及浓度测定  48-49
    4.8.1 蛋白质的纯化  48-49
    4.8.2 蛋白质浓度的测定  49
  4.9 重组蛋白的western blot鉴定  49-50
  4.10 BMDC体外培养生长情况  50-51
  4.11 负载FMDV VP1的BMDC激活T细胞表达IFN-γ和IL-4的检测  51-55
5 讨论  55-61
  5.1 重组菌pET32a(+)-VP1在大肠杆菌中的诱导表达  55-56
  5.2 重组蛋白包涵体的纯化  56-59
    5.2.1 包涵体的分离  57
    5.2.2 包涵体的洗涤与溶解  57-58
    5.2.3 包涵体的复性  58-59
  5.3 负载FMDV VP1的DC激活淋巴结T细胞的研究  59-61
6 结论  61-62
参考文献  62-69
附图及说明  69-71
在读期间发表的学术论文  71-73
作者简历  73-74
致谢  74

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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