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牛Asia1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白B细胞线性抗原表位鉴定

作　者: 宋军
导　师: 王君伟
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 口蹄疫病毒 3A非结构蛋白 B细胞线性表位 表位突变体
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV)引起的以感染偶蹄动物为主的急性、热性、高度传染性疫病。该病的发生和流行严重危害畜牧业的健康持续发展,造成巨大的经济损失,该病被世界动物卫生组织列为必须申报的多种动物共患传染病之一。多项研究表明检测3ABC抗体是最可靠的衡量感染与免疫动物的指标。3ABC-ELISA敏感性和特异性最好,是大规模检疫动物,区分疫苗免疫和自然感染的最有效方法。然而,抗3A非结构蛋白的抗体存在于一些疫苗免疫的动物当中,影响3ABC检测的特异性。3A非结构蛋白是口蹄疫病毒最重要的非结构蛋白之一,免疫原性最强,能够刺激机体产生非结构蛋白抗体。因此在前人研究的基础上,对3A非结构蛋白抗原表位进行深入研究。为了鉴定Asia1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白的B细胞线性表位,设计了15(A1~A15)个覆盖整个Asia1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白的多肽片段,每一个多肽片段合成一对寡核酸片段,经磷酸化、退火后插入表达载体pET-32a(+)进行融合表达,经Western blot和ELISA分析表明A8和A11融合蛋白能够被Asia1型口蹄疫感染血清所识别,鉴定表明A8和A11为Asia1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白的B细胞线性抗原表位区。为了进一步鉴定Asia1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白的B细胞线性抗原表位,设计了13个覆盖A8和A11的多肽片段,分别进行融合表达,表达的13个融合蛋白经Western blot鉴定并将Asia1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白的B细胞线性抗原表位精确定位于A8-3(V90NEYIDKA97)和A11-12-Z7(A109EKNPLE115)。在鉴定Asia1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白的基础上,利用MEGA4序列分析软件,对226个不同型FMDV(A、O、C和Asia1)的3A非结构蛋白氨基酸序列进行比对,结果表明只有第95位Asp发生置换以外其他氨基酸基本保守。为了进一步验证A8-3 (V90NEYIDKA97),根据参考序列比对结果和氨基酸的结构类型、亲疏水性和极性构建表位突变体A8-3-E(VNEYIEKA)和A8-3-F(VNEYIFKA)。A8-3-E(VNEYIEKA)存在于大多数FMDV(A、O、C和Asia1)血清型中,而A8-3-F(VNEYIFKA)不存在于任何血清型中。基于以A8-3和A11-12-Z7为抗原建立间接ELISA方法,用于临床检测牛血清样品,能够区分出阴阳性。综合上述实验结果,对Asia1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白的B细胞线性抗原表位精确定位、构建表位突变体和以表位A8-3和A11-12-Z7为抗原建立间接ELISA方法,能够用于检测感染牛血清,不仅可以了解口蹄疫病毒的抗原结构,还为进一步研究其功能及口蹄疫的诊断方法奠定基础。

全文目录


摘要  8-9
英文摘要  9-11
1 引言  11-24
  1.1 口蹄疫的流行及其危害  11-12
  1.2 口蹄疫病毒的生物学特性  12-15
    1.2.1 口蹄疫病毒的形态特征和理化特性  12-13
    1.2.2 病毒基因组结构及功能  13-15
  1.3 口蹄疫病毒的复制和抗感染免疫机制  15
  1.4 口蹄疫实验室检测方法进展  15-21
    1.4.1 病毒分离  16
    1.4.2 血清学检测技术  16-19
    1.4.3 分子生物学及其他检测技术  19-21
  1.5 口蹄疫病毒3A 非结构蛋白研究进展  21-22
  1.6 研究的目的和意义  22-24
2 材料与方法  24-38
  2.1 实验材料  24-25
    2.1.1 质粒、载体与菌种  24
    2.1.2 工具酶  24
    2.1.3 分子生物学试剂  24
    2.1.4 生化试剂  24
    2.1.5 血清及酶标抗体  24
    2.1.6 主要仪器  24-25
  2.2 实验方法  25-38
    2.2.1 Asia1 型口蹄疫病毒3A 基因的克隆、表达及抗原性鉴定  25-29
    2.2.2 Asia1 型口蹄疫病毒3A 非结构蛋白 B 细胞线性表位的初步鉴定  29-32
    2.2.3 Asia1 型口蹄疫病毒3A 非结构蛋白 B 细胞线性表位的精确定位  32-35
    2.2.4 3A 非结构蛋白 B 细胞线性表位的序列比对分析  35
    2.2.5 3A 非结构蛋白 B 细胞线性表位的突变体构建及抗原性鉴定  35-37
    2.2.6 3A 非结构蛋白 B 细胞线性表位与 Asia1 型口蹄疫感染阳性血清的反应  37-38
3 结果与分析  38-54
  3.1 Asia1 型口蹄疫病毒3A 基因的克隆、表达及抗原性鉴定  38-41
    3.1.1 Asia1 型口蹄疫病毒3A 基因片段的 PCR 扩增结果  38
    3.1.2 克隆载体pMD18-T-Asia1-3A 构建及序列测定  38
    3.1.3 原核表达载体pET-32a-Asia1-3A 的构建  38-39
    3.1.4 Asia1 口蹄疫病毒3A 基因在大肠杆菌中的诱导表达、纯化  39-40
    3.1.5 Asia1-3A 基因表达蛋白的 Western blot 鉴定  40-41
  3.2 Asia1 型口蹄疫病毒3A 非结构蛋白 B 细胞线性表位的初步鉴定  41-45
    3.2.1 原核表达载体pET-32a-Asia1-A1-A15 的构建  41-42
    3.2.2 Asia1 型口蹄疫病毒 A1-A15 在大肠杆菌中的诱导表达与纯化  42-43
    3.2.3 Asia1 型口蹄疫病毒 A1-A15 表达蛋白的 Western blot 分析  43-45
    3.2.4 Asia1 型口蹄疫病毒 A1-A15 表达蛋白的 ELISA 分析  45
  3.3 Asia1 型口蹄疫病毒3A 非结构蛋白 B 细胞线性表位的精确定位  45-49
    3.3.1 短肽原核表达载体的构建  45-48
    3.3.2 短肽基因在大肠杆菌中的诱导表达与纯化  48-49
    3.3.3 表达短肽融合蛋白的 Western blot 分析  49
  3.4 Asia1 型口蹄疫病毒3A 非结构蛋白 B 细胞线性表位的分布  49-50
  3.5 Asia1 型口蹄疫病毒3A 非结构蛋白 B 细胞线性表位的序列比对分析  50-51
  3.6 Asia1 型口蹄疫病毒3A 非结构蛋白 B 细胞线性表位的突变体构建及抗原性鉴定  51-52
    3.6.1 表位突变体表达载体的构建  51
    3.6.2 表位突变体的诱导表达  51
    3.6.3 表位突变体的 Western blot 分析  51-52
  3.7 3A 非结构蛋白 B 细胞线性表位与 Asia1 型口蹄疫感染阳性血清的反应  52-54
4 讨论  54-57
  4.1 Asia1 型口蹄疫病毒3A 非结构蛋白作为表位筛选的目的蛋白的依据  54
  4.2 小于20 个氨基酸的短肽基因的克隆策略  54
  4.3 Asia1 型口蹄疫病毒3A 非结构蛋白 B 细胞线性表位的精确定位  54-55
  4.4 Asia1 型口蹄疫病毒3A 非结构蛋白 B 细胞线性表位突变体的构建  55
  4.5 Asia1 型口蹄疫病毒3A 非结构蛋白 B 细胞线性表位的应用前景  55-57
5 结论  57-58
致谢  58-59
参考文献  59-66
攻读硕士学位期间发表的学术论文  66

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 牛
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