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牛朊蛋白局部片段的克隆、表达功能研究及检测方法的研究

作　者: 张大川
导　师: 刘志国
学　校: 武汉工业学院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 牛PrP 大肠杆菌BL21(DE3) 克隆原核表达 FGP
分类号: S852.659.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

克隆、表达牛朊蛋白(PrionProtein,PrP)的局部特征片段,研究PrP的结构、性质并对其检测进行初步探索。根据表达牛PrP90~231氨基酸片段的基因序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成了覆盖该基因序列的12个寡核苷酸片段,运用重叠延伸PCR合成出表达PrP90~231片段的DNA序列,经测序鉴定后将该序列克隆至原核表达系统pET-28a(+)上,CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,并优化表达条件,利用载体pET-28a(+)上的6×His标签对表达产物经Ni+-NTA亲和层析、纯化。将获得的重组PrP蛋白用于PrP结构性质的研究,并建立一种新的检测途径。实验结果显示成功合成了PrP的DNA片段,构建出pET-28a(+)-PrP重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,并建立了最佳表达条件,即在IPTG浓度0.8mmol/L,诱导时间6h时,目的蛋白表达量最高。表达产物经Ni+-NTA树脂亲和层析纯化后纯度达95%以上,相对分子量为19.55KDa,与预期值相符。与致病型PrP(PrPsc)具有蛋白酶K抗性不同,得到的重组PrP可被蛋白酶K完全水解;相似地是,该重组片段与FGP(一种能与PrPsc特异结合的蛋白质)间同样有特异性结合,测得结合常数Ka值约为105mol/L。表明该重组PrP与PrPsc具有相似的特性,因其为PrP上的一区间片段,故不具备完整蛋白的感染性,可作为一种安全的PrP蛋白模型。利用重组PrP与FGP间的高选择性亲和作用,将FGP富集检测样品中的PrP,然后对富集液中的PrP进行Westernblot检测,得到PrP检出限为0.5pmol/L。与传统免疫检测方法(检出限为3~5pmol/L)相比,灵敏度提高6-10倍。本研究通过构建pET-28a(+)-PrP,获得了高表达且具有较好应用价值的PrP片段,为PrP结构、性质、致病机制及检测等的研究提供了一种安全的模型。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-11
第1章绪论  11-18
  1.1 PrP 的性质与结构  11-12
  1.2 朊蛋白病  12-13
    1.2.1 朊蛋白病的发现  12
    1.2.2 病理特征  12-13
    1.2.3 致病机制  13
  1.3 PrP 的检测方法  13-16
    1.3.1 生物学检测（Bioassay）  13-14
    1.3.2 免疫学检测  14-15
    1.3.3 蛋白错误折叠循环扩增法  15
    1.3.4 毛细管电泳法  15-16
  1.4 与 PrP 相关的蛋白质的研究—噬菌体 G 蛋白（ FGP）  16
    1.4.1 噬菌体 G 蛋白（FGP）的性质  16
    1.4.2 FGP 与 PrP 相互作用  16
  1.5 基因工程方法获得 PrP  16-17
  1.6 研究目的  17-18
第2章牛朊蛋白局部片段的克隆  18-39
  2.1 材料  18-20
    2.1.1 菌株和质粒  18-19
    2.1.2 工具酶及主要试剂  19
    2.1.3 相关试剂配置  19-20
    2.1.4 实验仪器及设备  20
  2.2 方法  20-34
    2.2.1 引物设计  20-22
    2.2.2 PrP 片段的基因克隆  22-30
    2.2.3 重组质粒的制备与构建  30-33
    2.2.4 转化  33-34
    2.2.5 重组质粒鉴定及序列分析  34
  2.3 结果  34-37
    2.3.1 重叠延伸 PCR 扩增  34-36
    2.3.2 重组质粒的鉴定  36-37
    2.3.3 扩增产物序列分析  37
  2.4 讨论  37-39
第3章目的基因的诱导表达、纯化，包涵体蛋白的复性及蛋白酶 K 抗性研究  39-55
  3.1 材料  39-41
    3.1.1 质粒和菌株  39
    3.1.2 试剂  39
    3.1.3 相关试剂配制  39-41
    3.1.4 实验仪器及设备  41
  3.2 方法  41-46
    3.2.1 目的基因的诱导表达  41-42
    3.2.2 重组蛋白的 SDS-PAGE 分析  42-44
    3.2.3 表达条件优化  44
    3.2.4 目的蛋白的表达形式  44
    3.2.5 重组蛋白的纯化  44-46
    3.2.6 重组蛋白的复性  46
    3.2.7 重组 PrP 蛋白酶 K（PK）抗性研究  46
  3.3 结果  46-52
    3.3.1 目的基因的诱导表达  46-47
    3.3.2 表达条件优化  47-49
    3.3.3 目的蛋白的表达形式  49-50
    3.3.4 重组蛋白的纯化  50-51
    3.3.5 重组蛋白的复性  51
    3.3.6 重组 PrP 蛋白酶 K（PK）抗性研究  51-52
  3.4 讨论  52-55
第4章重组 PrP 多克隆抗体的制备及鉴定  55-63
  4.1 材料  55-56
    4.1.1 实验动物  55
    4.1.2 试剂  55
    4.1.3 主要试剂配制  55-56
    4.1.4 主要仪器和设备  56
  4.2 方法  56-60
    4.2.1 多抗制备  56-57
    4.2.2 Western blot 鉴定重组蛋白  57-59
    4.2.3 兔多克隆抗体纯化  59-60
  4.3 结果  60-61
    4.3.1 Western blot 鉴定重组蛋白  60-61
    4.3.2 多克隆抗体的纯化  61
  4.4 讨论  61-63
第5章 FGP 蛋白与重组 Pr P 结合能力分析及重组 PrP 检测方法探究  63-73
  5.1 材料  63-64
    5.1.1 试验用蛋白  63
    5.1.2 试剂  63
    5.1.3 相关试剂及配制  63-64
    5.1.4 主要实验仪器  64
  5.2 方法  64-66
    5.2.1 重组 PrP 与 FGP 蛋白结合力分析  64-66
    5.2.2 Western blot 检测重组 PrP 组织模拟样品  66
  5.3 结果  66-71
    5.3.1 重组 PrP 与 FGP 蛋白结合  66-70
    5.3.2 Western blot 测定PrP检出限  70-71
  5.4 讨论  71-73
第6章结论和建议  73-75
  6.1 主要结论  73-74
  6.2 建议  74-75
参考文献  75-83
致谢  83-84
附录  84-86
攻读学位期间的研究成果  86

牛朊蛋白局部片段的克隆、表达功能研究及检测方法的研究

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