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蛋白G的IgG Fc段结合域克隆、表达及功能研究

作　者: 房国梁
导　师: 刘志国
学　校: 武汉工业学院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 蛋白G的IgG Fc段结合域 大肠杆菌BL21(DE3) 原核表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


克隆、表达蛋白G的IgG Fc段结合域（PGFB）,用于抗体的纯化。根据PGFB的氨基酸序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成了4个寡核苷酸片段。通过重叠延伸PCR方法合成了PGFB的DNA片段,测序鉴定后克隆至原核表达系统pET-28a（+）上;CaCl2法转化大肠杆菌BL21（DE3）,利用IPTG诱导蛋白表达并对表达条件进行优化,利用载体pET-28a（+）上的6×His标签使表达产物经Ni+-NTA亲和层析树脂纯化,并偶联到琼脂糖凝胶6B上,用于纯化多克隆抗体。实验结果显示成功合成了PGFB的DNA片段,构建了pET-28a（+）-PGFB重组质粒,并在大肠杆菌BL21（DE3）中得以表达,确定了最佳表达条件即:IPTG浓度1.0mmol/L,诱导时间9h,表达量最高。表达产物经Ni+-NTA亲和层析树脂纯化后纯度达到90%以上,相对分子量为12.25KDa,与预期值相符。通过Western Blot实验证实克隆所得的PGFB蛋白具有与多克隆抗体IgG相结合的能力。绘制了PGFB与IgG结合饱和曲线,测得多克隆抗体的最高结合量为（0.79±0.051）mol/molPGFB。根据Scatchard作图求得解离常数Kd值为（7.33±2.17）×10-6mol/L。另外确定了琼脂糖凝胶活化的最佳条件即NaOH浓度为1.0mol/ L、加入环氧氯丙烷的量为2.5mL/g琼脂糖凝胶、反应时间在4h时活化度最高。偶联产物纯化多克隆抗体达到了良好的效果,每毫升基质可结合20mg抗体。本研究通过构建pET-28a（+）-PGFB,获得了高效表达且具有较好抗体亲和能力的PGFB,为多克隆抗体的快速纯化提供了方便。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
第1章 绪论  10-15
  1.1 SPG 的分子结构及结合特性  10-13
    1.1.1 分子量  10
    1.1.2 分子结构  10
    1.1.3 SPG 中Fc 段结合区的结构分析  10-11
    1.1.4 SPG 的结合特性  11-13
  1.2 SPG 的提取方法  13
  1.3 基因工程方法获得特异性SPG  13-14
  1.4 SPG 的应用  14-15
第2章 PGFB 的克隆  15-29
  2.1 材料  15-17
    2.1.1 菌株和质粒  15-16
    2.1.2 工具酶及主要试剂  16
    2.1.3 相关试剂配制  16
    2.1.4 实验仪器及设备  16-17
  2.2 方法  17-24
    2.2.1 引物的设计  17-18
    2.2.2 PGFB 的基因克隆  18-20
    2.2.3 重组质粒的制备  20-23
    2.2.4 转化  23-24
    2.2.5 重组质粒鉴定及序列分析  24
  2.3 结果  24-27
    2.3.1 目的基因的PCR 扩增  24-25
    2.3.2 重组质粒的构建及鉴定  25-26
    2.3.3 扩增产物的序列分析  26-27
  2.4 讨论  27-29
第3章 目的基因的诱导表达及蛋白的分离纯化  29-40
  3.1 材料  29-30
    3.1.1 菌株和质粒  29
    3.1.2 试剂  29
    3.1.3 相关试剂配制  29-30
    3.1.4 实验仪器及设备  30
  3.2 方法  30-33
    3.2.1 目的基因的表达  30-31
    3.2.2 目的蛋白的SDS-PAGE 分析  31-32
    3.2.3 表达条件优化  32
    3.2.4 目的蛋白的纯化  32-33
    3.2.5 纯化后蛋白的定量（Bradford 法）  33
  3.3 结果  33-38
    3.3.1 目的基因的诱导表达  33-34
    3.3.2 表达条件优化  34-36
    3.3.3 重组蛋白纯化  36-38
    3.3.4 纯化后蛋白的定量（Bradford 法）  38
  3.4 讨论  38-40
第4章 重组蛋白的功能研究  40-49
  4.1 材料  40-41
    4.1.1 实验用蛋白  40
    4.1.2 试剂  40
    4.1.3 相关试剂配制  40-41
    4.1.4 主要实验仪器  41
  4.2 方法  41-44
    4.2.1 兔多克隆抗体的粗纯化  41
    4.2.2 Western Blot 鉴定重组蛋白的功能  41-43
    4.2.3 重组蛋白与多克隆抗体结合力的分析  43
    4.2.4 环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶条件的优化  43
    4.2.5 重组蛋白与琼脂糖凝胶的偶联及功能鉴定  43-44
    4.2.6 重组蛋白琼脂糖凝胶的功能鉴定  44
  4.3 结果  44-48
    4.3.1 Western Blot 鉴定重组蛋白的功能  44
    4.3.2 重组蛋白与多克隆抗体结合能力的分析  44-46
    4.3.3 环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶条件的优化  46-48
    4.3.4 重组蛋白与琼脂糖偶联后功能的鉴定  48
  4.4 讨论  48-49
第5章 结论和建议  49-50
  5.1 主要结论  49
  5.2 建议  49-50
参考文献  50-55
致谢  55-56
附录  56-58
攻读学位期间的研究成果  58

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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