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随着除草剂的广泛应用,百草枯中毒日渐普遍,现已成为继急性有机磷中毒之后的常见农药中毒,且呈逐年上升趋势。绝对死亡病例数居近几年农药中毒的第一位。百草枯(paraquat, PQ)又名对草快,国内商品名为克芜踪,化学名称为1.1’-二甲基-4.4’联吡啶二硫甲酯二氧化物,是目前世界上广泛使用的有机杂环类接触性脱叶除草剂,对人畜有较强毒性。百草枯可经皮肤、呼吸道、消化道吸收进入人体,口服吸收率为5%～15%,吸收后1～4 h血浆浓度可达到峰值。百草枯进入人体后可使肺、肾、肝和胰腺出现损伤,其特征性的改变是肺损伤,早期表现为上皮细胞受损、肺泡内出血水肿、炎性细胞浸润,晚期则出现肺泡内及肺间质纤维化,导致急性呼吸窘迫,是百草枯中毒死亡患者的主要原因。百草枯造成肺损伤的主要机制是百草枯进入人体后经聚胺类物质摄取系统被肺泡上皮细胞主动摄取并转运至肺内,然后形成氧化还原循环,同时产生以阳离子、超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基等为代表的活性氧(ROS),从而导致肺部的氧化损伤。由于百草枯中毒死亡率高,目前尚无特效解毒剂,所以针对百草枯造成的氧化损伤,国内外学者采用各种抗氧化药物如依地酸钙钠、依达拉奉等西药和丹参、贯叶连翘提取物、银杏叶提取物等中药进行了一系列的相关研究,以期能缓解中毒症状,但中毒患者的预后仍很差,且死亡率非常高。因此,如何更有效地减轻百草枯中毒所导致的机体损伤,改善患者的预后,是目前急切需要进行探索的。白藜芦醇(Resveratrol, Res)在植物界中分布非常广泛,已在21科、31属的72种植物中发现有白藜芦醇,如葡萄科的葡萄属、豆科的落花生属和决明属、百合科的藜芦属等。白藜芦醇是这些植物为抵抗外界刺激如紫外线、真菌、病毒感染或机械损伤而产生的一种植物抗毒素(phytoalexin)。研究表明,白藜芦醇能抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗自由基,具有保护肝脏、神经、心血管系统的功能,具有调节免疫、植物雌激素的作用,还有影响骨代谢和拮抗内皮素等生物学作用。目前,白藜芦醇的抗氧化作用已成为近年的研究热点。白藜芦醇具有较强的抗氧化活性,其抗氧化作用要强于维生素E和维生素C,而它清除自由基,尤其是羟自由基的能力,更是使它能更好地保护细胞,使DNA免受损伤。RLE-6TN细胞株是大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞。肺泡上皮细胞特别是Ⅱ型上皮细胞在百草枯相关肺损伤的发生发展过程中起着极其重要的作用。Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)是肺泡上皮细胞的“干细胞”,它的功能多样：能增殖成新的Ⅱ型上皮细胞,可以分化为其他细胞女Ⅰ型上皮细胞,能够合成和分泌表面活性物质,并具有转运肺内体液的功能和强大的免疫功能等。在正常情况下Ⅱ型上皮细胞转化为Ⅰ型上皮细胞以修复肺部的损伤,但当对Ⅱ型上皮细胞造成严重损伤甚至严重凋亡时其修复功能就会受阻,从而造成肺部更严重的损伤。本课题先检索1991-2008年来中国大陆有关百草枯中毒的临床文献,对文献中百草枯中毒的流行病学特征进行总结与分析,从而更好地了解我国百草枯中毒及临床救治的情况；再以百草枯和白藜芦醇为受试物,以大鼠RLE-6TN细胞为研究对象,研究百草枯对肺泡Ⅱ型上皮细胞所造成的氧化损伤,同时探讨白藜芦醇的抗氧化作用能否拮抗百草枯对肺泡Ⅱ型上皮细胞所造成的氧化损伤而起到保护作用,以期能为解决百草枯中毒的难题提供新的依据。1资料与方法1.1 1991-2008年我国百草枯中毒文献分析以百草枯中毒为主题词,通过中国期刊全文数据库(http://dlib.cnki.net/kns50)检索1991-2008年来国内医学专业期刊发表的有关百草枯中毒的文献,共获555篇。经逐篇分类与查重,剔除其中非病例性、资料不全及内容或作者重复等文献,最终以369篇文献作为研究对象,搜集整理相关数据,分析百草枯中毒病例的一般情况、地区分布、中毒原因、接触途径、治疗及转归等情况。1.2建立百草枯染毒的细胞模型以RLE-6TN细胞为受试对象,采用MTT法检测百草枯染毒后的细胞增殖及细胞毒性改变情况。细胞以1×105个/mL接种于96孔板,培养24 h贴壁后,分别加入终浓度为200μmol/L,400μmol/L,600μmol/L,800μmol/L,1000μmol/L,2000μmol/L,4000μmol/L的百草枯,对照组则加入等量的培养基,继续培养24 h；终止培养前4 h每孔加入MTT溶液20μL,继续培养4 h后,弃上清,每孔加入150μL的DMSO,振荡10 min,使蓝色结晶充分溶解；在波长570nm处,于酶标仪检测。细胞活性以与对照组相比的百分数表示,并筛选出百草枯损伤的最佳浓度。1.3 MTT法检测细胞经白藜芦醇和百草枯处理后的活性变化细胞以1×105个/mL接种于96孔板,培养24 h后分别加入终浓度为0μmol/L,20μmol/L,40μmol/L,60μmol/L,80μmol/L,100μmol/L,120μmol/L的白藜芦醇再培养2 h,然后分别加入终浓度为1000μmol/L的百草枯,对照组则同步加入等量的培养基,继续培养24 h；终止培养前4 h每孔加入MTT溶液20μL,继续培养4 h后,弃上清,每孔加入DMSO 150μL,振荡10 min,使蓝色结晶充分溶解；于酶标仪在波长570 nm处检测吸光度值。细胞活性以与对照组相比的百分数表示。1.4测定超氧化歧化酶(SOD)活性细胞分为4组,设1个空白对照组,1个百草枯损伤组(浓度为1000μmol/L),2个白藜芦醇保护组(浓度分别为60μmol/L,80μmol/L)。受试物处理后,均按超氧化歧化酶试剂盒操作进行检测。1.5测定乳酸脱氢酶(LDH)活性细胞分为4组,设1个空白对照组,1个百草枯损伤组(浓度为1000μmol/L),2个白藜芦醇保护组(浓度分别为60μmol/L,80μmol/L)。受试物处理后,按乳酸脱氢酶试剂盒的操作说明进行检测。1.6流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡细胞分为4组,设1个空白对照组,1个百草枯损伤组(浓度为1000μmol/L),2个白藜芦醇保护组(浓度分别为60μmol/L,80μmol/L)。受试物处理后,按Annexin V-FIFC细胞凋亡检测试剂盒进行检测。1.7百草枯对RLE-6TN细胞的DNA损伤作用及白藜芦醇的保护作用细胞分为4组,设1个空白对照组,1个百草枯损伤组(浓度为1000μmol/L),2个白藜芦醇保护组(浓度分别为60μmol/L,80μmol/L);受试物处理后,进行单细胞凝胶电泳检测。根据拖尾细胞占总细胞的比例,来判断细胞DNA的损伤,并将DNA损伤程度分级。1.8统计学处理采用SPSS 13.0版本进行统计学分析,不同浓度百草枯处理后的细胞活性检测、不同浓度白藜芦醇处理后的细胞活性检测、细胞培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)活力测定和细胞培养基中的超氧化岐化酶(SOD)活力测定均采用单向方差分析(One-Way ANOVA),并进行多重比较分析,所得数据以均数±标准差(x±s)表示,P<0.05有统计学意义。各组DNA损伤程度比较采用多个样本率比较的卡方检验,P<0.05有统计学意义。2结果2.1我国1991-2008年的百草枯中毒情况全国各地1991-2008年因口服百草枯中毒及死亡的人数明显增加,以河南,四川,山东等省为多；青壮年为主,女性约占2/3。绝大多数病例为口服自杀。文献报告总死亡率接近50%。临床救治主要是减少百草枯吸收、促其排泄及对抗百草枯毒性损伤；及早采用各种血液净化疗法可能有效。2.2百草枯处理后细胞活性的变化百草枯可损伤细胞,使细胞活性下降,各组的细胞活性随着百草枯浓度的升高而下降,呈明显的浓度依赖性；除200μmol/L组外,其余各组的吸光值与对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)其中1000μmol/L百草枯组的细胞活性为57.17%,接近LC50,取该浓度造模,作为PQ损伤组。2.3白藜芦醇和百草枯处理后的细胞活性改变先经白藜芦醇的处理,可以增强细胞活性,各浓度白藜芦醇组的细胞活性均强于百草枯损伤组,尤其是60μmol/L和80μmol/L白藜芦醇组(P<0.05)。2.4细胞培养基中的超氧化歧化酶(SOD)活性变化百草枯可引起细胞培养基中超氧化歧化酶的下降,各受试组的超氧化歧化酶活力明显弱于对照组(P<0.05)；而先经过白藜芦醇的处理,可以明显地使细胞培养基中的超氧化歧化酶升高,60μmol/L白藜芦醇组和80μmol/L白藜芦醇组的超氧化歧化酶活力均高于百草枯组(P<0.05)2.5细胞培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)活性变化百草枯可引起细胞培养基中乳酸脱氢酶的升高,各受试组乳酸脱氢酶活力明显强于对照组(P<0.05)；而先经过白藜芦醇的处理,可以有效降低细胞培养基中的乳酸脱氢酶,60μmol/L白藜芦醇组和80μmol/L白藜芦醇组的乳酸脱氢酶活力均低于百草枯组。2.6细胞凋亡现象百草枯可引起细胞的凋亡,各受试组的细胞凋亡率均高于对照组；而先经白藜芦醇的处理,可以降低百草枯引起的细胞凋亡,60μmol/L白藜芦醇组和80μmol/L白藜芦醇组的细胞凋亡率均低于百草枯组。2.7百草枯对RLE-6TN细胞DNA的损伤及白藜芦醇的保护作用经单细胞凝胶电泳试验发现,百草枯可造成细胞DNA的损伤,各受试组细胞的拖尾率均高于对照组；而先经过白藜芦醇的处理,可以减轻百草枯所造成的细胞DNA的损伤,60μmol/L白藜芦醇组和80μmol/L白藜芦醇组的细胞拖尾率均低于百草枯组。3结论3.1百草枯中毒特别是自服百草枯中毒已成为我国重要的医学及社会问题,其中毒人数呈逐年上升趋势,中毒死亡率已接近50%,而有效的治疗方法尚待探索。3.2 1000μmol/L百草枯可对RLE-6TN细胞造成严重的氧化损伤,引起超氧化歧化酶活力下降和乳酸脱氢酶活力的升高,诱导细胞凋亡发生,造成细胞DNA损伤。3.3白藜芦醇能改善百草枯对RLE-6TN细胞造成的氧化损伤,降低细胞的凋亡率,减轻细胞DNA损伤。
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