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BMP-7对马兜铃酸致人肾小管上皮细胞损伤的保护作用研究

作　者: 王梓华
导　师: 黄云剑
学　校: 第三军医大学
专　业: 内科学
关键词: 马兜铃酸 肾小管上皮细胞 增殖 凋亡 转分化 BMP-7
分类号: R692.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


背景和目的:近年来,含马兜铃酸(aristolochic acid, AA)成分的中草药所致的肾损害―马兜铃酸肾病(aristolochic acid nephropathy, AAN)已越来越受到国内外学者的重视。动物实验和临床病理资料已证实AAN病理主要表现为进行性肾小管间质纤维化(renal tubulointerstitial fibrosis,RIF)。由于AAN比一般慢性间质性肾炎进展迅速,数月或1-2年内即可发展为终末期肾功能衰竭,预后极差,危害较大,因此探讨AAN的发生机制及并设计相应的防治方法尤为重要,由此产生的新认识和治疗药物将为临床提高AAN防治水平提供重要的帮助。骨形态发生蛋白-7(Bone morphogenetic protein-7,BMP-7),也被称之为成骨蛋白-1(Osteogenic Protein-1,OP-1),属于转化生长因子β(Transforming growth factorβ,TFG-β)超家族中的一个亚群。研究已经发现BMP-7在肾发育和多种肾疾病模型中(单侧输尿管梗阻肾模型、肾缺血模型、糖尿病肾病模型、IgA肾病模型等)发挥重要的抗损伤作用,但BMP-7能否保护AA对肾小管损伤尚不清楚。本课题通过建立AAN的体外细胞损伤模型,研究AA所致肾小管损伤的机制并探讨BMP-7的可能保护机制。方法:本课题分2部分进行探讨。第一部分:观察马兜铃酸对人肾小管上皮细胞(Human renal tubular epithelial cells,HK-2)的损伤作用,筛选出AA对HK-2细胞的最佳致伤浓度。实验分组如下:正常对照组(仅加入培养液),AA30组(AA的终浓度30μmol/L),AA60组(AA的终浓度60μmol/L),AA120组(AA的终浓度120μmol/L)。第二部分:探讨BMP-7对马兜铃酸致HK-2细胞损伤的保护作用。根据第一部分的研究得出AA对HK-2细胞的最佳致伤浓度是60μmol/L。实验分组如下:正常对照组(仅加入培养液), AA60组(AA的终浓度60μmol/L), AA60+BMP500组(AA的终浓度60μmol/L,BMP-7的终浓度是500ng/ml),AA60+BMP1000组(AA的终浓度60μmol/L,BMP-7的终浓度是1000ng/ml)。细胞培养48h后,为了观察AA引起的细胞损伤表现以及BMP-7是否有保护作用,进行以下指标的检测。倒置相差显微镜观察细胞形态的变化,通过生化法测定细胞上清液中LDH的含量和CCK8检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测激活型Caspase-3的表达,免疫荧光染色检测细胞α-SMA和E-cadherin的表达,ELISA测定细胞上清液中TGF-β1和Ⅲ型胶原的含量。旨在观察AA对HK-2细胞增殖、凋亡、膜损伤及上皮-间充质转分化(Epithelial to mesenchymal transition,EMT)的影响,探讨其可能机制及BMP-7对AA所致HK-2细胞损伤的保护作用机制。结果:第一部分:1、正常对照组HK-2细胞呈现鹅卵石样结构,AA30组中部分细胞伸长呈梭形,AA60组大多数细胞胞体拉长,呈现梭形,失去鹅卵石样上皮细胞结构,AA120组中多数细胞聚缩、变圆,发生坏死。2、AA可引起HK-2细胞增殖抑制,凋亡增加, LDH含量增加,凋亡可能与激活型Caspase-3表达增多有关。3、低浓度(30,60μmol/L)的AA可使HK-2细胞E-cadherin表达减弱,α-SMA表达增强,TGF-β1和Ⅲ型胶原分泌增加。4、在60μmol/L浓度的AA作用下,HK-2细胞损伤表现典型,有明显的EMT形态学改变,因此选用此浓度作为AA对HK-2细胞的最佳致伤浓度进行第二部分的实验。第二部分:在AA60+BMP500组和AA60+BMP1000组中观察到,与AA60组比较,细胞形态改变不明显,细胞增殖增加,凋亡率降低,激活型Caspase-3的表达及LDH释放减少,TGF-β1及Ⅲ型胶原的分泌减少,且BMP-7浓度越高,上述表现越显著。结论:1、AA可引起HK-2细胞增殖抑制,凋亡增加,凋亡可能与激活型Caspase-3表达增多有关。2、低浓度(30,60μmol/L)的AA可促使HK-2细胞发生EMT,且EMT发生可能与TGF-β1分泌增加有关。3、BMP-7能有效减轻AA致HK-2细胞增殖抑制和凋亡作用,机制可能与其减少激活型Caspase-3的表达有关。4、BMP-7能有效逆转AA引起HK-2发生EMT作用,机制可能与其减少TGF-β1及ECM成分之一Ⅲ型胶原的分泌有关。总之,BMP-7在AA所致肾小管上皮细胞的损伤中起到重要的保护作用,为AAN的防治提供了新的思路。

全文目录


英文缩写一览表  4-5
英文摘要  5-8
中文摘要  8-11
论文正文 BMP-7 对马兜铃酸致人肾小管上皮细胞损伤的保护作用研究  11-55
  前言  11-13
  第一部分 马兜铃酸对人肾小管上皮细胞的损伤作用  13-32
    材料和方法  13-22
    结果  22-30
    讨论  30-31
    小结  31-32
  第二部分 BMP-7 在马兜铃酸致人肾小管上皮细胞损伤中的保护作用  32-43
    材料和方法  32-33
    结果  33-40
    讨论  40-42
    小结  42-43
  全文结论  43-44
  致谢  44-45
  照片  45-51
  参考文献  51-55
文献综述一 骨形态发生蛋白-7 与肾脏疾病  55-64
  参考文献  61-64
文献综述二 马兜铃酸与肾脏疾病  64-73
  参考文献  70-73
硕士在读期间发表的文章  73

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