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慢性氟中毒对大鼠脑海马钙离子信号通路的影响

作　者: 张璟
导　师: 章子贵
学　校: 浙江师范大学
专　业: 生态学
关键词: 慢性氟中毒海马神经毒性细胞凋亡钙离子信号通路
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

适量氟是维持机体正常生理活动的基础,但氟是一种蓄积性原生质毒物,机体长期过量摄入氟可引起氟骨症、氟斑牙等骨相器官的损害以及血液、神经系统等非骨相器官的损害。神经组织对氟的敏感性很高,海马作为中枢神经系统中氟中毒的靶部位之一,其神经细胞易受氟的影响而发生可塑性变化。近年来,通过对氟神经毒性作用机制的研究,人们主要提出了G蛋白信号转导理论与氧化应激理论。目前普遍认为,神经毒物引起的神经系统损伤与G蛋白信号转导通路中Ca2+稳态失调有密切关系。其机制可能与神经细胞内对氧化应激敏感且受钙离子调控的核转录因子(nuclear factor kappa-B, NF-κB)表达等有关。因此,本实验通过复制饮水型慢性氟中毒动物模型,以观察和检测氟中毒引起氟斑牙、血氟水平异常及海马神经细胞形态结构改变为基础,首次在氟的神经毒性研究中将钙离子信号通路与氧化应激理论结合,检测氟中毒对大鼠海马突触体内Ca2+浓度以及钙离子信号通路中CaMKⅡ、c-fos、NF-κB、Bcl-2及Bax蛋白表达的影响。研究方法：152只初断乳雄性SD大鼠随机分为四组,即对照组(饮用自来水,水氟含量低于0.5mg/L),低氟组、中氟组、高氟组(饮水含氟化钠分别为15mg/L、30mg/L、60mg/L)。各组以配制的溶液作为饮水唯一来源,自由摄食、饮水,饲养时间为18个月。染氟初期(3月龄)对大鼠进行氟斑牙和血氟检测,染氟中期(9月龄)和染氟结束(18月龄)分两批断头处死大鼠,HE染色检测海马CA3区病理学改变,荧光指示剂Fura-2/AM检测慢性氟中毒大鼠海马突触体内Ca2+浓度的变化,免疫组化法检测海马CA3区CaMKⅡα、c-fos、NF-κBρ65、Bcl-2及Bax蛋白表达的改变。1、过量氟摄入会导致大鼠氟斑牙发生,随染氟浓度升高,大鼠氟斑牙症状加剧,切齿明显变形、缺损并出现白垩状横纹；各染氟组血氟浓度与对照组相比显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)。表明动物氟中毒模型复制成功。2、HE染色结果显示,慢性氟中毒可损伤大鼠神经细胞形态结构。与对照组相比,染氟组大鼠海马神经细胞分布稀疏,细胞轮廓消失,并出现空泡。且这种变化随染氟时间和染氟浓度的递增而更为显著。3、突触体Ca2+浓度检测结果显示,随大鼠月龄增长,对照组突触体Ca2+浓度有升高的趋势,而染氟处理加剧了Ca2+的超载。染氟中期：与对照组相比,中氟组、高氟组突触体Ca2+浓度显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)；染氟结束：与对照组相比,中氟组、高氟组突触体Ca2+浓度极显著升高(P<0.01)。4、IHC结果显示,随大鼠月龄增长,对照组及各染氟组CaMKⅡα、c-fos、NF-κBρ65蛋白表达均有不同水平的上升,且染氟时间和染氟剂量的递增使这种变化更为显著。染氟中期：与对照组相比,中氟组、高氟组CaMKⅡα表达显著升高(P<0.05),c-fos表达显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),NF-κBρ65表达虽无显著性差异,但随染氟剂量升高其表达有上升的趋势；染氟结束：与对照组相比,中氟组、高氟组CaMKⅡαc-fos表达极显著升高(P<0.01),中氟组NF-κBρ65表达显著升高(P<0.05)。5、IHC结果显示,随大鼠月龄增长,对照组及各染氟组Bcl-2和Bax蛋白表达水平均有不同水平的下降,且染氟时间和染氟剂量的递增使这种变化更为显著。染氟中期：与对照组相比,中氟组、高氟组Bcl-2表达显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01),Bax表达极显著下降(P<0.01)；染氟结束：与对照组相比,中氟组、高氟组Bcl-2表达显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01),低氟组、中氟组、高氟组Bax表达显著或极显著下降(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。同时,染氟中期：Bax与Bcl-2比值(Bax/Bcl-2)随染氟时间和染氟浓度的递增有升高的趋势；染氟结束：与对照组相比,中氟组、高氟组Bax/Bcl-2比值显著上升(P<0.05),提示神经细胞处于凋亡状态。综合上述,慢性氟暴露对中枢神经系统有毒性作用。氟可导致海马神经细胞形态结构发生改变,引起海马突触体Ca2+超载,继而导致钙离子信号通路中CaMKⅡα、c-fos、NF-κBρ65、Bcl-2及Bax的蛋白表达异常,最终诱导神经细胞趋于凋亡。衰老过程中,神经细胞的退行性改变也可导致大鼠神经细胞凋亡,而染氟处理加剧了这种变化。本研究进一步阐明了氟神经毒性对钙离子信号通路影响的分子机理,为深入探讨慢性氟中毒对中枢神经系统毒性作用的分子生物学机制提供了一定的理论基础。此外,NF-κB的表达与染氟时间、浓度有敏感的量效关系,可能是氟神经毒性相关靶分子,这为开展氟神经毒性的生物标志物研究提供一定的理论依据。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-10
目录  10-12
符号说明  12-13
1 绪论  13-22
  1.1 地方性氟中毒研究概况  13-14
  1.2 氟的生物学效应  14
  1.3 氟毒性的研究进展  14-17
    1.3.1 氟中毒对骨相组织的影响  14-15
    1.3.2 氟中毒对血液的影响  15
    1.3.3 氟中毒对神经系统的影响  15-16
    1.3.4 氟中毒对机体其他组织器官的影响  16-17
  1.4 氟中毒发病机制的研究进展  17-20
    1.4.1 氟诱导G蛋白信号转导理论  17-18
    1.4.2 氟致自由基损伤和氧化应激理论  18-19
    1.4.3 氟与其他元素相互作用  19-20
  1.5 存在问题与本研究目的和意义  20-22
2 氟中毒对大鼠氟斑牙及血氟水平的影响  22-27
  2.1 引言  22-23
  2.2 材料与方法  23-24
    2.2.1 实验动物  23
    2.2.2 模型制作方法  23
    2.2.3 主要器材和试剂  23
    2.2.4 氟斑牙的检测  23-24
    2.2.5 血氟浓度的测定  24
    2.2.6 统计学处理  24
  2.3 结果  24-25
    2.3.1 氟斑牙观察结果  24
    2.3.2 血氟浓度检测结果  24-25
  2.4 讨论  25-27
3 慢性氟中毒对海马突触体Ca~(2+)浓度及CA_3区CaMKⅡ、c-fos表达的影响  27-40
  3.1 引言  27
  3.2 材料与方法  27-32
    3.2.1 实验动物  27
    3.2.2 模型制作方法  27-28
    3.2.3 主要器材和试剂  28
    3.2.4 海马突触体内Ca~(2+)浓度的测定  28-30
    3.2.5 脑海马CA_3区内CaMKⅡ、c-fos表达水平的测定  30-31
    3.2.6 图像分析  31
    3.2.7 统计学处理  31-32
  3.3 实验结果  32-37
    3.3.1 HE染色结果  32-33
    3.3.2 慢性氟中毒对大鼠海马突触体Ca~(2+)浓度的影响  33
    3.3.3 慢性氟中毒对大鼠海马CA_3区CaMKⅡα蛋白表达的影响  33-35
    3.3.4 慢性氟中毒对大鼠海马CA_3区c-fos蛋白表达的影响  35-37
  3.4 讨论  37-40
4 慢性氟中毒对海马CA_3区NF-κβ、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响  40-50
  4.1 引言  40
  4.2 材料与方法  40-41
    4.2.1 实验动物  40-41
    4.2.2 模型制作方法  41
    4.2.3 主要器材和试剂  41
    4.2.4 海马CA_3区内NF-κB、Bcl-2、Bax表达水平的测定  41
    4.2.5 图像分析  41
    4.2.6 统计学处理  41
  4.3 实验结果  41-48
    4.3.1 慢性氟中毒对大鼠海马CA_3区NF-κB ρ65蛋白表达的影响  41-43
    4.3.2 慢性氟中毒对大鼠海马CA_3区Bcl-2、Bax蛋白表达的影响  43-48
  4.4 讨论  48-50
5 结论  50-51
参考文献  51-61
附录  61-63
致谢  63-64
攻读学位论文期间发表的学术论文目录  64-65

慢性氟中毒对大鼠脑海马钙离子信号通路的影响

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