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一种蛇毒组分对神经细胞的选择性毒性及作用机理的初步研究

作　者: 吴远双
导　师: 白洁
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: CTXI 高分PC12细胞 神经毒性
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


蛇毒组分丰富、含有多种蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质,而且活性多样,是人类迄今为止研究最多,利用最多的动物毒素。目前发现蛇毒中含有神经毒、细胞毒、肌肉毒素、磷脂酶A2、凝血酶样酶、血小板聚集抑制因子、去整合素、C型凝集素样蛋白及神经生长因子等多种蛋白活性成分,其中多种成分被用做治疗疾病的药物。而其中的神经毒cobrotoxin、弱毒神经毒cobrotoxin b、c以及多个心脏毒cardiotoxin、类心脏毒碱性蛋白(CLBP)等在一级结构极为相近,三级结构上也有相似之处,都形成了三指状结构,但他们的功能却相差巨大,是研究蛋白质结构与功能关系的极好模型。我们从中华眼镜蛇毒中分离纯化得到一个弱毒心脏毒蛋白,MOLDI-TOF测定了其分子量,Edman降解法测定了其N端20个残基序列,确定此蛋白为之前通过cDNA文库发现的Cardiotoxin I,其序列与Cardiotoxin类似,属心脏毒家族。但随后的实验研究发现,该蛋白不仅具有弱细胞毒性,还具有弱神经毒性和镇痛活性,属三指蛋白中的过渡类型。对其生理活性的研究将为三指蛋白结构功能进化与分化的研究探讨奠定基础,对蛋白质结构功能关系这一重大基础理论课题的研究具有重要意义。具体实验结果：在较低的浓度2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml CTX I的作用下,该组分对Hela细胞、HepG2细胞及低分化PC12细胞的生长抑制不明显,而对高分化PC12细胞有明显的生长抑制作用,抑制率分别达到28%、56%、67%和72%。从形态上观察前三种细胞无明显变化,而高分化PC12细胞则出现明显的皱缩和凋亡现象。进一步研究发现,CTXⅠ对高分化PC12细胞的毒性具有浓度及时间依赖性。以高分化PC12细胞为研究模型,通过抑制剂实验发现,纳洛酮对其毒性具有一定抑制作用,但并不能完全回复CTXⅠ对高分化PC12细胞生长的抑制,并通过小鼠实验发现,CTXⅠ具有弱的镇痛活性。此外,通过对CTXⅠ对高分化PC12细胞中的一些细胞周期蛋白cyclin D1、凋亡蛋白(caspase-9, caspase-3等)和氧化还原系统相关蛋白TRX,及成瘾相关蛋白CDK5表达的影响对其可能的作用机制进行了探讨。我们认为低浓度CTXⅠ对高分化PC12细胞周期G1期有阻滞作用,能诱导高分化PC12细胞凋亡。在该过程中硫氧还蛋白表达未发生明显变化,说明CTXⅠ引起的毒性作用未引起细胞的氧化还原状态明显的改变,或者通过其他氧化还原系统进行了调节。CDK5的表达未发生明显变化,说明CTXⅠ的作用和成瘾不相关,而据报道蛇毒神经毒也具有不成瘾性。综上所述,本研究发现了CTXⅠ对不同细胞的毒性有差异,并对高分化PC12细胞有较强选择性,能通过将细胞阻滞在G1和诱导细胞凋亡来抑制细胞的生长,并结合相关实验及研究确定了CTXⅠ具有弱的神经毒性和镇痛活性,指出CTXⅠ可能是三指蛋白中的过渡类型。对其生理活性的研究将为三指蛋白结构功能进化与分化的研究探讨提供实验基础,具有重要研究意义。

全文目录


摘要  4-6Abstract  6-8目录  8-11插图和附表清单  11-13缩略语索引  13-14第一章 绪论  14-28  1.1 蛇毒组分简介  14-23    1.1.1 蛇毒中细胞毒的作用机制研究进展  15-20    1.1.2 蛇毒中神经毒素的作用机制研究进展  20-23  1.2 本文涉及的神经细胞膜上神经递质系统简介  23-25    1.2.1 酰胆碱系统  23-24    1.2.2 谷氨酸受体系统  24    1.2.3 阿片肽及阿片受体系统  24-25  1.3 本论文研究的目的和意义以及研究策略  25-28    1.3.1 本论文研究的目的和意义  25-27    1.3.2 本论文研究策略  27-28第二章 眼镜蛇蛇毒中CTX Ⅰ的分离纯化及鉴定  28-42  2.1 引言  28-29  2.2 实验技术路线  29-30  2.3 材料与方法  30-34    2.3.1 材料与试剂  30-31    2.3.2 主要仪器设备  31    2.3.3 主要溶液及配制  31-32    2.3.4 实验方法  32-34  2.4 实验结果  34-39    2.4.1 分离纯化结果  34-36    2.4.2 电泳确定蛋白纯度及质谱测定分子量  36-37    2.4.3 目标蛋白的N-端测序  37-39  2.5 分析与讨论  39-42第三章 CTX Ⅰ对不同细胞系的选择性毒性作用研究  42-55  3.1 引言  42-43  3.2 实验技术路线  43-44  3.3 材料和方法  44-48    3.3.1 实验细胞和主要试剂  44    3.3.2 主要溶液及配制  44-45    3.3.3 主要仪器设备  45-46    3.3.4 实验方法  46-48  3.4 实验结果  48-53    3.4.1 CTX Ⅰ对Hela细胞的生长的影响及形态比较  48-50    3.4.2 CTX Ⅰ对HepG2细胞生长的影响  50-51    3.4.3 CTX Ⅰ对低分化PC12细胞生长的影响  51    3.4.4 CTX Ⅰ对高分化PC12细胞生长的影响及形态比较  51-53  3.5 分析与讨论  53-55第四章 CTX Ⅰ对高分化PC12细胞的作用机制的研究  55-66  4.1 引言  55-56  4.2 实验技术路线  56-57  4.3 材料和方法  57-59    4.3.1 激动剂或抑制剂简介  57-58    4.3.2 实验方法  58-59  4.4 实验结果  59-64    4.4.1 CTX Ⅰ对高分化PC12细胞毒性的浓度依赖性  59    4.4.2 CTX Ⅰ对高分化PC12细胞毒性的时间依赖性  59-60    4.4.3 氯化乙酰胆碱对CTX Ⅰ的毒性的影响  60-61    4.4.4 MK801对CTX Ⅰ毒性的影响  61-62    4.4.5 KN-62对CTX Ⅰ毒性的影响  62-63    4.4.6 纳络酮对CTX Ⅰ毒性的影响  63    4.4.7 CTX Ⅰ的镇痛活性实验  63-64  4.5 分析与讨论  64-66第五章 CTX Ⅰ对高分化PC12细胞中的一些相关蛋白表达的影响  66-78  5.1 引言  66  5.2 材料与方法  66-74    5.2.1 实验细胞  66    5.2.2 主要试剂  66-68    5.2.3 主要仪器设备  68-69    5.2.4 主要试剂的配制  69-70    5.2.5 实验方法  70-74  5.3 实验结果  74-76    5.3.1 CTX Ⅰ对cyclin D1表达的影响  74    5.3.2 CTX Ⅰ对细胞凋亡蛋白表达的影响  74-75    5.3.3 CTX Ⅰ对硫氧还蛋白表达的影响  75    5.3.4 CTX Ⅰ对CDK5表达水平的影响  75-76  5.4 分析与讨论  76-78第六章 全文总结  78-79致谢  79-80参考文献  80-89附录A  89

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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