学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

荧光假单胞菌GcM5-1A鞭毛蛋白对黑松的作用机理及蛋白酶抑制剂防治松褐天牛的应用研究

作　者: 李盛楠
导　师: 郭道森
学　校: 青岛大学
专　业: 微生物学
关键词: 荧光假单胞菌 GcM5-1A 鞭毛蛋白黑松半胱氨酸蛋白酶抑制剂松褐天牛
分类号: S763.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 28次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

采用细胞免疫荧光分析、细胞染色观察、电导率测定以及基因组DNA电泳分析技术,对松材线虫携带的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens GcM5-1A)分泌的鞭毛蛋白对黑松愈伤组织细胞的作用及其致死方式进行研究。结果表明,鞭毛蛋白与黑松(Pinus thunbergii)细胞之间存在直接的相互作用；鞭毛蛋白处理的细胞,细胞膜皱缩变形、细胞质浓缩、细胞核解体,形成若干小核,细胞质中的RNA降解；处理细胞的着色力增强,细胞培养液的电导率增加,说明鞭毛蛋白可增加处理细胞的细胞膜透性；基因组DNA的电泳分析证实,处理细胞的DNA发生了断裂,但无明显的梯子形成,推测鞭毛蛋白对黑松细胞的致死方式为非典型的细胞凋亡。为进一步验证鞭毛蛋白的毒性,本实验构建了组成分泌表达载体pUC18ompA,将荧光假单胞菌Pf-5鞭毛蛋白的编码基因fliC克隆到pUC18ompA构建pUC18ompA-fliC,重组质粒转化E.coli BL21(DE3)构建了工程菌。工程菌与无菌松材线虫混合接种黑松无菌苗,研究其对无菌苗的致病能力。接种试验结果表明,工程菌与无菌松材线虫混合接种同样可以引起黑松无菌苗的萎蔫。进一步验证了体内荧光假单胞菌鞭毛蛋白在松萎蔫病致病过程中的作用。本研究还对松萎蔫病的防治做了初步探讨。从沙蚕(Perinereis aibuhitensis Grube)的cDNA文库中筛选并鉴定了一半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPI)基因。氨基酸序列分析结果显示,该基因编码蛋白与斑马鱼(Danio rerio) Zgc:153129,水蛭cystatin B以及人ChainA, stefin B四聚体的同源性分别为51%,48%和48%。CPI基因克隆到胞内表达载体pET-15b,并在大肠杆菌中表达。经Ni+亲和层析和DEAE-Sepharose FF离子交换层析纯化重组CPI (PA-CPI).聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析推测,PA-CPI相对分子量为16 KDa。活性分析显示,重组蛋白能够抑制木瓜蛋白酶的蛋白水解活性。将CPI编码基因亚克隆到组成分泌表达载体并进行胞外表达。Western-blotting分析结果显示,PA-CPI能够分泌到培养基中。生测结果表明,携带pUC18ompAcat-CPI质粒的E. coli DH5a对松褐天牛(Monochamus alternatus)和光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)的致死率与未转化的E. coliDH5a和培养基对照相比均具有显著性差异。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-8
引言  8-11
第1章荧光假单胞菌鞭毛蛋白对黑松细胞的致死作用  11-19
  1.1 材料与方法  11-13
    1.1.1 实验材料及主要仪器  11
    1.1.2 实验方法  11-13
      1.1.2.1 细胞培养  11
      1.1.2.2 黑松愈伤组织培养  11-12
      1.1.2.3 鞭毛蛋白的纯化及其抗血清制备  12
      1.1.2.4 蛋白质浓度测定  12
      1.1.2.5 鞭毛蛋白处理黑松悬浮细胞  12
      1.1.2.6 鞭毛蛋白与黑松悬浮细胞的相互作用  12
      1.1.2.7 悬浮细胞的形态学观察  12-13
      1.1.2.8 基因组DNA的检测  13
      1.1.2.9 鞭毛蛋白对黑松悬浮细胞膜透性的影响  13
  1.2 结果与分析  13-16
    1.2.1 鞭毛蛋白与黑松愈伤组织悬浮细胞的相互作用  13
    1.2.2 细胞形态学观察  13-14
      1.2.2.1 台盼兰染色结果  14
      1.2.2.2 Giemsa染色  14
      1.2.2.3 吖啶橙染色  14
    1.2.3 基因组DNA的电泳检测  14-15
    1.2.4 鞭毛蛋白对黑松愈伤组织细胞膜透性的影响  15-16
  1.3 讨论  16-19
第2章表达荧光假单胞菌鞭毛蛋白工程菌的构建及其对黑松的毒性  19-28
  2.1 材料与方法  19-22
    2.1.1 实验菌株、质粒及主要仪器  19
    2.1.2 实验方法  19-22
      2.1.2.1 表达载体与工程菌构建  19-20
      2.1.2.2 鞭毛蛋白在工程菌中的表达  20
      2.1.2.3 松材线虫的来源与培养  20
      2.1.2.4 无菌松材线虫的获得  20-21
      2.1.2.5 黑松无菌苗的获得  21
      2.1.2.6 接种实验  21
      2.1.2.7 接种后细菌和线虫的再分离  21-22
      2.1.2.8 萎蔫松苗中鞭毛蛋白的检测  22
  2.2 结果与分析  22-26
    2.2.1 组成分泌型鞭毛蛋白表达载体的构建  22-23
    2.2.2 组成分泌型鞭毛蛋白工程菌的构建与表达  23-24
    2.2.3 无菌黑松苗接种情况  24-25
    2.2.4 细菌和线虫的再分离  25
    2.2.5 松苗中鞭毛蛋白的Western-blotting检测  25-26
  2.3 讨论  26-28
第3章沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆表达及其在防治松褐天牛方面的应用  28-41
  3.1 材料与方法  28-32
    3.1.1 实验材料及主要仪器  28-29
    3.1.2 实验方法  29-32
      3.1.2.1 cDNA文库的构建  29
      3.1.2.2 序列测定及分析  29
      3.1.2.3 胞内表达质粒的克隆  29
      3.1.2.4 CPI的胞内表达及纯化  29-30
      3.1.2.5 CPI活性分析  30
      3.1.2.6 组成分泌型表达的载体的构建  30-31
      3.1.2.7 亚克隆和胞外表达  31
      3.1.2.8 CPI的胞外表达及纯化  31
      3.1.2.9 SDS-PAGE和Western-blotting分析  31
      3.1.2.10 抗虫活性分析  31-32
  3.2 结果  32-39
    3.2.1 双齿围沙蚕cDNA文库的构建和基因的筛选  32
    3.2.2 核苷酸序列及推测氨基酸序列分析  32-33
    3.2.3 PA-CPI的胞内表达及纯化  33-34
    3.2.4 PA-CPI的抑制剂活性分析  34-35
    3.2.5 组成分泌型载体pUC18ompAcat的描述  35-36
    3.2.6 CPI的胞外表达及纯化  36-37
    3.2.7 生测分析  37-39
  3.3 讨论  39-41
结论  41-42
参考文献  42-49
综述  49-59
综述参考文献  59-66
攻读学位期间的研究成果  66-67
附录  67-71
致谢  71-72

荧光假单胞菌GcM5-1A鞭毛蛋白对黑松的作用机理及蛋白酶抑制剂防治松褐天牛的应用研究

内容摘要

全文目录

相似论文