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松材线虫携带的荧光假单胞菌GcM5-1A过氧化物酶的研究

作　者: 孔令营
导　师: 李荣贵
学　校: 青岛大学
专　业: 微生物学
关键词: 松萎蔫病荧光假单胞菌GcM5-1A 木质素过氧化物酶过氧化物酶基因克隆
分类号: S763.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

松材线虫病(Pine wilt disease, PWD)主要通过松褐天牛为宿主传播,是由松褐天牛携带的松材线虫(Bursaphelenchus xyluphilus)引起的一种松树毁灭性传染疾病。PWD可以对多种松属的植物造成危害。由于松材线虫病的发生和发展过程中涉及到松树寄主、媒介昆虫、松材线虫、相关的微生物以及环境条件等多种因素,而这些因素之间构成了复杂的关系,所以给该病的致病机理研究以及防治工作造成了难度。本实验研究了松材线虫携带的荧光假单胞菌GcM5-1A的培养液经硫酸铵分级沉淀后各组分中木质素过氧化物酶(LiP)的活性及各组分对黑松悬浮细胞的毒性。本文还对GcM5-1A菌株胞外LiP进行了初步纯化,并对纯化后的酶学性质进行了研究。结果表明：LiP活性主要出现在50%-70%沉淀组分中；除了0-20%沉淀组分,50-70%沉淀组分对黑松悬浮细胞的毒性也很强。GcM5-1A菌株培养液经硫酸铵分级沉淀以及DEAE-Sepharose FF两步纯化后,其LiP的比活力从0.81 U/mg提高到21.30 U/mg。其最适温度为35℃,最适pH为4.0。在15-35℃、pH6.0-9.0范围内,酶活保持相对稳定。NH2OH.HCl和KCN对酶活的抑制作用分别达到88%和57%,而NaN3对酶活的抑制作用只有15%左右。吸收光谱显示该酶在406 nm处有一个Soret峰,加入1mmol/L Na2S2O4后,吸光度出现了明显的下降,但Soret峰没有显著移动。另外,我们构建了荧光假单胞菌GcM5-1A菌株的基因组文库,并且通过生物活性测定的方法从文库中筛选出一个产毒素的转化子。我们对核苷酸序列进行了测定,结果表明该序列含一个1290 bp的开放读框。信号分析软件推测N末端有一个36个氨基酸的信号肽。同源性分析显示,毒素基因的核苷酸序列与P. fluorescens SBW25的PFLU2919基因,P. fluorescens Pf-5的Dyp类型过氧化物酶家族基因以及P.fluorescens Pf0-1的Tat转移酶分别有83%,82%和80%的相似性。我们分别克隆了编码全长蛋白的基因和去掉信号肽的基因,并在E. coli BL21中进行了可溶性表达、探索了目的蛋白最适诱导表达条件。通过Ni2+亲和层析的方法得到了纯化的全长以及去掉信号肽的重组蛋白。生测结果表明全长以及去掉信号肽的重组蛋白都对黑松的悬浮细胞显示了毒性。HPLC分析显示,加入全长重组蛋白和过氧化氢的黑松松枝提取物组分发生了明显的变化,这说明此种毒素蛋白可能是一种过氧化物酶。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-7
引言  7-12
第一章荧光假单胞菌GCM5-1A胞外木质素过氧化物酶的初步纯化及性质研究  12-23
  1 材料与方法  12-16
    1.1 材料  12-13
      1.1.1 菌株  12
      1.1.2 主要试剂  12
      1.1.3 主要仪器设备  12-13
    1.2 方法  13-16
      1.2.1 细菌培养  13
      1.2.2 黑松愈伤组织培养及黑松愈伤组织悬浮细胞的制备  13-14
      1.2.3 生物活性测定  14
      1.2.4 木质素过氧化物酶的酶活测定及蛋白含量测定  14
      1.2.5 木质素过氧化物酶的分离纯化  14-15
      1.2.6 温度对酶活的影响  15
      1.2.7 酶的热稳定性  15
      1.2.8 pH对酶活的影响  15
      1.2.9 酶的pH稳定性  15
      1.2.10 不同金属离子对酶活的影响  15-16
      1.2.11 抑制剂对酶活的影响  16
      1.2.12 吸收光谱测定  16
  2 结果与分析  16-23
    2.1 GcM5-1A菌株培养液经硫酸铵分级沉淀后各组分的毒性测定及LiP活性分析  16-17
    2.2 GcM5-1A菌株胞外木质素过氧化物酶的初步纯化  17-18
    2.3 GcM5-1A菌株胞外LiP酶学性质测定  18-23
      2.3.1 温度对酶活力的影响  18
      2.3.2 pH对酶活力的影响  18-19
      2.3.3 酶的温度稳定性  19
      2.3.4 酶的pH稳定性  19-20
      2.3.5 金属离子对酶活的影响  20-21
      2.3.6 抑制剂对酶活的影响  21
      2.3.7 吸收光谱测定  21-23
第二章荧光假单胞菌GCM5-1A基因组文库的构建及毒素基因的筛选和克隆表达  23-40
  1 材料与方法  23-33
    1.1 材料  23
      1.1.1 菌株  23
      1.1.2 主要试剂  23
    1.2 方法  23-33
      1.2.1 荧光假单胞菌GcM5-1A菌株基因组文库的构建  23-26
      1.2.2 毒素基因的筛选  26-27
      1.2.3 基因序列分析  27
      1.2.4 克隆  27-30
      1.2.5 阳性克隆的扩大培养及目的蛋白的分离纯化  30-31
      1.2.6 黑松切根苗以及愈伤组织悬浮细胞的制备  31-32
      1.2.7 重组蛋白对黑松悬浮细胞的毒性  32
      1.2.8 重组蛋白对黑松切根幼苗的毒性  32
      1.2.9 HPLC分析重组蛋白对黑松松枝提取物的影响  32-33
  2 结果与分析  33-40
    2.1 荧光假单胞菌基因组文库的构建  33
    2.2 毒素基因的分离集DNA序列分析  33-35
    2.3 毒素基因的克隆、表达与纯化  35-36
    2.4 重组蛋白对黑松悬浮细胞及黑松切根苗的毒性测定  36-37
    2.5 重组蛋白对黑松切根苗萎蔫率测定  37-38
    2.6 HPLC分析重组蛋白对黑松松枝提取物的影响  38-40
结论  40-41
参考文献  41-49
综述  49-72
  参考文献  64-72
攻读学位期间的研究成果  72-73
致谢  73-74

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