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荧光假单胞菌毒蛋白的分离纯化与松材线虫的无异培养

作　者: 王维华
导　师: 赵博光
学　校: 南京林业大学
专　业: 森林保护学
关键词: 松材线虫荧光假单胞菌GcM5-1A 毒素蛋白黑松愈伤组织无异培养
分类号: S763.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

本研究对松材线虫携带的致病细菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens GcM5-1A菌株产生的毒素蛋白进行了分离、纯化及对分离后蛋白组分的生物活性进行了测定；同时，对松材线虫的无异培养进行了研究，主要的研究结果如下： 1．荧光假单胞菌GcM5-1A毒素原液经（NH₄）₂SO₄分级盐析及生物活性测定后得到毒性最强的组分；该组分先后依次经葡萄糖Sephadex G-100凝胶层析柱、DEAESephadex A-50阴离子交换柱及SP Sephadex C-50阳离子柱分离及对分离后各组分生物活性测定，得到其中毒性最强组分的纯化蛋白；对纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳，得该纯化蛋白的大致分子量为45000。 2．黑松愈伤组织对无菌松材线虫产卵量的影响的研究结果表明：无论是经冷冻处理失活的黑松愈伤组织还是活黑松愈伤组织，两者都能明显地促进松材线虫的产卵：黑松愈伤组织是否失活对松材线虫产卵量没有显著影响。 3．荧光假单胞菌GcM5-1A菌株对松材线虫产卵量的影响的研究结果表明：用经三氯甲烷处理后的死荧光假单胞菌GcM5-1A与活荧光假单胞菌GcM5-1A都对松材线虫的产卵量有显著的促进作用；荧光假单胞菌GcM5-1A是否死亡对松材线虫的产卵量没有显著影响。 4．研究表明：用死荧光假单胞菌加死黑松愈伤组织培养的无菌松材线虫的产卵量与用活黑松愈伤组织培养的野生松材线虫的产卵量之间没有差异，而用前者培养的无菌松材线虫的产卵量却显著多于单独用死黑松愈伤组织培养的无菌松材线虫的产卵量，说明用死荧光假单胞菌加死黑松愈伤组织比单独用黑松愈伤组织培养无菌松材线虫能促进松材线虫的繁殖。 5．对分别用活黑松愈伤组织、死荧光假单胞菌、活荧光假单胞菌以及死荧光假单胞菌加死黑松愈伤组织四种介质培养的第一代和第二代无菌松材线虫雌雄成虫体长、体直径及体积进行观察测定，结果表明，无论是第一代还是第二代，用死荧光假单胞菌加死愈伤组织培养的无菌松材线虫雌雄成虫的体长、体直径和体积都明显大于用其它三种介质培养的松材线虫雌雄成虫的体长、体直径和体积，说明与其它三种介质相比，死荧光假单胞菌加死黑松愈伤组织能明显促进无菌松材线虫的生长发育。综上所述，本研究首次对松材线虫携带的致病细菌荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescents）GcM5-1A菌株产生的毒素蛋白进行分离、纯化及生物活性测定，得到了毒性最强的纯化蛋白；经测定其分子量约为45000。本研究首次报道了用死荧光假单胞菌加死黑松愈伤组织培养无菌松材线虫的新方法；该方法比单独用黑松愈伤组织培养无菌松材线虫在线虫产卵量及生长繁殖方面更好。

全文目录

引言  13-14
第一章文献综述  14-25
  1 松材线虫病致病机理的研究进展  14-21
    1.1 病理生理学研究  14
    1.2 组织病理学研究  14-15
    1.3 酶学研究  15-16
    1.4 松材线虫携带细菌的致萎毒素的研究进展  16-21
      1.4.1 松材线虫携带的致病细菌  17
      1.4.2 对松材线虫携带细菌的致病性的研究  17-18
      1.4.3 松材线虫携带细菌的致萎毒素研究的生测方法  18-19
      1.4.4 对松材线虫携带细菌的致萎毒素的化学性质的研究  19-21
    结语  21
  2 松材线虫人工培养的研究进展  21-25
    2.1 松材线虫生长繁殖的营养来源  21-22
    2.2 松材线虫的单异培养  22-23
    2.3 松材线虫的无异培养  23-24
    结语  24-25
第二章荧光假单胞菌毒蛋白的分离与纯化  25-40
  1 材料和方法  25-31
    1.1 试验材料  25
      1.1.1 供试菌种  25
      1.1.2 生测材料  25
      1.1.3 试剂  25
      1.1.4 试验仪器  25
    1.2 试验方法  25-31
      1.2.1 荧光假单胞菌菌株GcM5-1A的获得和培养  25
      1.2.2 黑松愈伤组织的培养(梁波，2003)  25-26
      1.2.3 荧光假单胞菌GcM5-1A毒素的培养、分离及分离后各组分生物活性的测定  26-28
      1.2.4 20％-80％(NH_4)_2SO_4沉淀的分离及分离后各组分生物活性的测定  28
      1.2.5 Sephadex G-100柱中毒性最强组分的分离及分离后组分的生物活性测定  28-29
      1.2.6 DEAE Sephadex A-50柱中毒性最强组分经SP Sephadex C-50阳离子交换后各组分的生物活性测定  29-30
      1.2.7 SP Sephadex C-50阳离子交换柱中毒性最强组分的SDS-PAGE电泳处理  30-31
  2 结果与分析  31-39
    2.1 荧光假单胞菌GcM5-1A毒素原液分级盐析后各组分的毒性测定  31-32
    2.2 20％-80％(NH_4)_2SO_4沉淀的分离及分离后各组分生物活性的测定  32-34
      2.2.1 20％-80％(NH_4)_2SO_4沉淀的分离  32-33
      2.2.2 20％-80％(NH_4)_2SO_4沉淀经Sephadex G-100分离后各组分生物活性的测定  33-34
    2.3 Sephadex G-100柱中毒性最强组分的分离及分离后组分的生物活性测定  34-36
      2.3.1 Sephadex G-100柱中毒性最强组分的分离  34-35
      2.3.2 Sephadex G-100柱中毒性最强组分分离后各组分的生物活性测定  35-36
    2.4 DEAE Sephadex A-50柱中毒性最强组分经SP Sephadex C-50阳离子交换后各组分的生物活性测定  36-38
      2.4.1 DEAE Sephadex A-50柱中毒性最强组分的分离  36-37
      2.4.2 SP Sephadex C-50阳离子交换分离后备组分生物活性测定  37-38
    2.5 纯化蛋白的SDS-PAGE电泳  38-39
  3 小结  39-40
第三章松材线虫的无异培养  40-63
  1 黑松愈伤组织对松材线虫产卵量的影响  40-42
    1.1 材料和方法  40-41
      1.1.1 试验材料  40
      1.1.2 试验方法  40-41
    1.2 结果与分析  41-42
  2 荧光假单胞菌GcM5-1A对松材线虫产卵量的影响  42-44
    2.1 材料和方法  42-43
      2.1.1 试验材料  42
      2.1.2 试验方法  42-43
    2.2 结果与分析  43-44
  3 黑松愈伤组织和荧光假单胞菌几种不同培养介质对松材线虫产卵量的影响  44-47
    3.1 材料和方法  44-46
      3.1.1 试验材料  44-45
      3.1.2 试验方法  45-46
    3.2 结果与分析  46-47
  4 黑松愈伤组织和荧光假单胞菌几种不同培养介质对松材线虫生长发育的影响  47-61
    4.1 材料与方法  47-49
      4.1.1 试验材料  47
      4.1.2 试验方法  47-49
    4.2 结果与分析  49-61
      4.2.1 第一代雌雄成虫的观察测量结果  49-55
      4.2.2 第二代雌雄成虫的观察测量结果  55-61
  5 小结  61-63
第四章结论与讨论  63-66
  1 结论  63-64
  2 讨论  64-66
    2.1 松材线虫携带细菌的致萎毒素研究  64-65
    2.2 无菌松材线虫的培养  65-66
参考文献  66-72

荧光假单胞菌毒蛋白的分离纯化与松材线虫的无异培养

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