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鲢鱼卵CPIs的纯化鉴定及其抑制鱼糜凝胶软化的研究

作　者: 宋川
导　师: 李树红
学　校: 四川农业大学
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 鲢鱼卵半胱氨酸蛋白酶抑制剂纯化鉴定凝胶软化
分类号: TS254.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本研究通过综合运用各种层析方法,从鲢鱼卵中分离纯化了两种小分子半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CPIs),并鉴定了其理化和生物学性质,为进一步深入研究鲢色CPIs奠定基础。同时探讨了两种小分子CPIs在抑制鲢鱼鱼糜凝胶软化中的作用,以期开发为鱼糜凝胶弹性增强剂,为合理高效利用鲢鱼下脚料提供了理论依据。首先明确了papain水解azocasein底物的酶反应初速度条件(azocasein 2.5mg, papain 6.25μg,反应30min或papain用量18.75μg,反应10mmin),并用E-64标定了papain(1.25mg/mL)的有效摩浓度为6.05μM。在此基础上,分别用azocasein法和荧光底物法对怀卵期(Ⅳ期)鲢鱼卵及皮匀浆液中的半胱氨酸蛋白酶抑制(CPI)对papain的抑制活性进行了比较,结果azocasein法证明Ⅳ期卵中CPI活性量(90.03unit/ml)高于皮(26.96 unit/ml),而皮中CPI比活(14.19unit/mg)高于卵(3.98unit/mg),而荧光底物法尽管具有较高的灵敏度,但是却检测不到卵均浆液中CPI抑制活性。对总活性量较高的鲢鱼卵CPIs进行了粗分离提取(匀浆、酸处理、盐析透析、超滤浓缩)。对各提取步骤同时采用azocasein法和荧光底物法进行监测,发现酸处理后的各步骤,用荧光底物法可以检测到鱼卵CPI抑制活性。选取鲢鱼卵的CPI超滤浓缩粗提液为材料进行层析纯化,层析过程中,以灵敏度更高的荧光合成肽底物(Z- Phe-Arg-MCA)法监测CPI抑制活性。经Sp Sepharose Fast Flow阳离子交换层析,获得Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性峰。选择其中分离较好,抑制活性高,且紫外吸收值低的Ⅰ峰和Ⅲ峰部分进行深入纯化鉴定。Ⅰ峰经Sephacryl S-100分子筛层析、LH-20反相层析得到了纯化。最终结果表明卵中的CPI-Ⅰ纯化了25.25倍,收率为1.26%。CPI-Ⅰ在还原性SDS-PAGE呈现分子量为10.5KDa一条带,与利用Sephacryl S-100分子筛层析marker标准曲线,初步判断分子量为11KD的结果相符合。反相酶谱法证明该10.5KDa蛋白能够抑制papain对底物明胶的水解。PAS染色证明其为非糖蛋白。CPI-Ⅰ在pH3.0-pH7.0条件下稳定,残余抑制活性均在60%以上,且热稳定性试验表明,CPI在60℃以下稳定,残余抑制活性均在80%以上。利用Dixon-plot作图法测得CPI-Ⅰ属于竞争性抑制剂,抑制常数Ki为96.97 nM。Ⅲ峰经Blue Sepharose 6 Fast Flow染料亲和层析、Sephacryl S-200分子筛层析、ConA Sepharose4B亲和层析得到了部分纯化。最终结果表明卵中的CPI-III纯化了331.66倍,收率为0.78%。CPI-III在还原性SDS-PAGE上呈现两条小分子量的条带,以及利用Sephacryl S-200分子筛层析marker标准曲线分子量分别为16.5KDa和12KDa。反相酶谱鉴定证明其中16.5KDa的蛋白带是半胱氨酸蛋白酶抑制因子。PAS染色证明CPI-III为非糖基化蛋白。鱼糜凝胶软化的抑制研究表明,当纯化的CPI-I及部分纯化CPI-III在鲢鱼糜中的添加量同为3units/g (azocasein法)时,它们均明显抑制了鱼糜凝胶软化,相对于对照组,破断力分别增加了9.8%(p>0.05)和115.6%(0.01<p<0.05),凝胶强度分别增加了28.96%(p<0.01)和32.36%(p<0.01)。试验组和对照组鲢鱼糜蛋白的SDS-PAGE检测表明,添加纯化的鲢鱼卵CPI-I及部分纯化CPI-III,可显著抑制半胱氨酸蛋白酶引起的肌球蛋白的降解,与对照组(%)相比,添加CPIs减小了肌球蛋白降解率(16.2%和17.93)。因此,可将鲢鱼卵CPI用于抑制其自身鱼糜的凝胶软化。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
1. 文献综述与立题依据  12-21
  1.1 立题依据  12-13
  1.2 半胱氨酸蛋白酶抑制因子概述  13-16
    1.2.1 Cystatin超家族的分类  13-14
    1.2.2 Cystatin超家族的分子结构特征  14-16
  1.3 Cystatin的纯化鉴定研究进展  16-17
    1.3.1 陆生动物来源Cystatin  16
    1.3.2 鱼类来源的Cystatin的纯化鉴定研究进展  16-17
  1.4 Cystatin在食品领域的应用  17-20
    1.4.1 利用Cystatin抑制鱼糜凝胶软化  17-19
    1.4.2 Cystatin作为影响肉质的候选因子  19
    1.4.3 Cystatin在鱼卵及幼鱼发育中的作用及与肉质的潜在关系  19-20
  1.5 Cystatin的生理作用  20-21
  1.6 研究目的意义及主要研究内容  21
2. 材料与方法  21-36
  2.1 材料  21-24
    2.1.1 试验材料  21-22
    2.1.2 主要仪器设备  22-23
    2.1.3 主要试验试剂  23-24
  2.2 方法  24-36
    2.2.1 CPI抑制活性测定  24-27
    2.2.2 鲢鱼卵、皮中CPIs活性的比较  27
    2.2.3 蛋白浓度测定  27-28
    2.2.4 鲢鱼卵CPIs的层析纯化  28-29
    2.2.5 鲢鱼卵CPI-Ⅰ的鉴定  29-33
    2.2.6 鲢鱼卵CPI-Ⅰ热稳定性pH稳定性抑制常数  33-34
    2.2.7 CPI-Ⅰ对鲢鱼cathepsinB及cathepsinL的抑制活性  34
    2.2.8 纯化CPIs对鲢鱼鱼糜凝胶软化的抑制作用  34-36
3.结果与分析  36-57
  3.1 papain水解Azocasein的酶反应线性范围确定  36
  3.2 E-64滴定法确定papain有效浓度  36-37
  3.3 荧光标品AMC的标准曲线  37-38
  3.4 鲢鱼卵、皮中CPIs活性含量比较  38-39
  3.5 鲢鱼卵中CPIs的粗分离提取  39-40
  3.6 鲢鱼卵CPIs的层析纯化  40-44
    3.6.1 Sp Sepharose Fast Flow阳离子交换层析  40
    3.6.2 SephacrylS-100分子筛层析  40-41
    3.6.3 LH-20反相层析  41-42
    3.6.4 Blue Sepharose 6 Fast Flow染料亲和层析  42
    3.6.5 Sephacryl S-200分子筛层析  42-43
    3.6.6 ConASepharose4B亲和层析  43
    3.6.7 鲢鱼卵CPI-Ⅰ及CPI-Ⅲ的纯化表  43-44
  3.7 Sephacryl S-100分子筛层析marker的标准曲线及分子量测定  44-46
  3.8 Sephacryl S-200分子筛层析marker的标准曲线及分子量测定  46-47
  3.9 鲢鱼卵CPIs的SDS-PAGE反相酶谱及糖蛋白染色分析  47-52
    3.9.1 鲢鱼卵CPI-Ⅰ的SDS-PAGE分析  47-49
    3.9.2 鲢鱼卵CPI-Ⅰ的反相酶谱及糖蛋白染色分析  49
    3.9.3 鲢鱼卵CPI-Ⅲ的SDS-PAGE分析  49-51
    3.9.4 鲢鱼卵CPI-Ⅲ的反相酶谱及糖蛋白染色分析  51-52
  3.10 鲢鱼卵CPI-Ⅰ热稳定性pH稳定性抑制常数  52-54
    3.10.1 CPI-ⅠpH稳定性的测定  52
    3.10.2 CPI-Ⅰ热稳定性的测定  52-53
    3.10.3 CPI-Ⅰ抑制常数Ki  53-54
    3.10.4 CPI-Ⅰ对鲢鱼cathepsinB及cathepsinL的抑制活性  54
  3.11 纯化CPIs对鲢鱼鱼糜凝胶软化的抑制作用  54-57
    3.11.1 凝胶破断力测定  54-55
    3.11.2 凝胶强度测定  55-56
    3.11.3 鱼糜凝胶蛋白质图谱  56-57
4.讨论  57-60
  4.1 关于酶反应线性范围的确定以及E-64滴定确定酶有效浓度  57
  4.2 关于azocasein法和荧光肽底物法在抑制活性测定中的使用  57-58
  4.3 关于鲢鱼卵CPI-Ⅰ和CPI-Ⅲ的纯化及性质鉴定  58-59
  4.4 关于鲢鱼卵CPIs抑制cathepsin B和cathepsin L活性和鱼糜凝胶软化  59-60
结论  60-61
参考文献  61-68
致谢  68

鲢鱼卵CPIs的纯化鉴定及其抑制鱼糜凝胶软化的研究

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