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伏马菌素B₁人工抗原制备及其蛋白质芯片检测方法的建立

作　者: 刘海明
导　师: 吴德华；张海彬
学　校: 南京农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 真菌毒素伏马菌素B1 人工抗原检测蛋白质芯片
分类号: S816.17
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 8次
引　用: 0次
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内容摘要

伏马菌素(FB1)是一族主要由几种真菌产生的真菌毒素,广泛存在并污染各种农产品及谷物饲料,尤其以玉米及其制品中含量最大,对人类和动物的危害较大,其毒性主要有急性毒性、亚急性毒性、神经毒性、致癌性等。由于FB1的危害严重,每年因其造成的损失引起了全世界的普遍重视和关注。常见的检测FB1的方法有：薄层层析法(TLC)、高效液相法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)等。蛋白质芯片是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新方法,它是在基因芯片的基础上发展起来的,其原理是：抗原抗体都是蛋白质,利用芯片点样仪把能和抗体特异性结合的抗原高密度地固定到玻片或其他载体上,将待测样品和特异性抗体混合加入到芯片表面的抗原上,再加入荧光二抗染料,通过洗脱把非特异性结合的蛋白洗掉,利用间接竞争原理,当检测物含量高时,和抗原特异反应的抗体就少(荧光二抗也少),反之抗体就多(荧光二抗也多),再利用芯片扫描仪对芯片进行扫描,利用软件分析荧光信号及信噪比,测定检测物的含量；与传统的研究方法相比具有微型化、集成化、高通量化、灵敏度高、所需样品极少等优点。本实验制备了人工抗原FB1-OVA,并对其进行了鉴定和浓度测定,为FB1蛋白质芯片的制备提供了实验基础：利用间接竞争的检测原理,以荧光信号强度和信噪比对FB1蛋白质芯片进行研究。主要研究内容和方法如下：1、利用戊二醛(GA)一步法将FB1偶联到载体蛋白-卵清蛋白(OVA)上。偶联后的抗原(FB1-OVA)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定证明偶联成功,测定其浓度为1.08mg·mol-1。2、在蛋白质芯片的制备时,利用芯片点样仪在醛基化玻片上先点上制备的人工抗原FB1-OVA(点样环境：25℃,75%湿度),经过固定、封闭、加上已经制备好的的FB1抗体、加羊抗鼠IgG-CY3二抗等步骤,并用激光共聚焦扫描仪在激发波长553nm读取荧光信号,采用GenePixpro6.0对采集图象进行数据处理,从荧光信号和信噪比两方面进行对比,并制作FB1标品的竞争抑制曲线。采用正交实验确定了FB1人工抗原的最佳点阵浓度为25 ug.mL-’(抗原1：40稀释)、FB1抗体稀释1：1200,对人工抗原的固定条件、封闭液的选择、封闭时间、抗原抗体反应时间、二抗浓度等各因素进行了优化,得出：4℃过夜固定、37℃1%BSA封闭1 h、抗原抗体37℃反应1h、二抗羊抗鼠IgG-CY3 2 ug·mL-1为最佳工作条件。

全文目录

摘要 6-8ABSTRACT 8-10缩略语表 10-11第一部分文献综述 11-30 第一章伏马菌素概述 12-20 1 伏马菌素的化学结构及性质 12-13 2 伏马菌素的污染 13 3 伏马菌素的毒性与作用机理 13-16 4 伏马菌素B_1检测技术的研究 16-20 第二章蛋白质芯片技术及其研究进展 20-24 1 蛋白质芯片的分类 20 2 蛋白质芯片的应用 20-22 3 蛋白质芯片的前景 22-23 4 本研究的主要内容和意义 23-24 参考文献 24-30第二部分研究内容 30-60 第三章伏马菌素B_1人工抗原的制备及检测 32-38 1 材料与方法 32-34 2 结果 34-35 3 讨论 35-38 第四章伏马菌素B_1蛋白质芯片的研究 38-58 1 材料与方法 38-45 2 结果 45-54 3 讨论 54-58 参考文献 58-60全文结论 60-62附录:常用试剂的配制 62-64致谢 64

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