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华东葡萄抗白粉病转录因子基因VpRFL1的结构和亚细胞定位分析

作　者: 黎涛
导　师: 王跃进
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 园艺植物种质资源学
关键词: 华东葡萄抗白粉病转录因子基因基因克隆原核表达过量表达载体拟南芥亚细胞定位
分类号: S663.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

葡萄白粉病是由葡萄白粉病菌[ Uncinula necator (Schw.) Burr.]引起的一种世界性的真菌病害。中国是葡萄属植物最重要的原产地之一,中国野生葡萄蕴藏丰富的抗病种质资源。本研究以抗病的中国野生华东葡萄白河-35-1为材料,以构建cDNA文库中获得的EST序列为基础克隆抗白粉病相关的转录因子基因。以全长序列为基础,结合生物信息学方法对所获得的序列进行基因结构、同源性及理化性质的分析。转录因子基因VpRFL1的全长cDNA序列全长1324 bp(基因登录号:No. FJ356672),阅读框1053 bp,编码350个氨基酸,其氨基酸序列N端存在核定位信号,C端具有C4C4型类似于RING的锌指结构。通过PCR技术获得转录因子基因VpRFL1的DNA全长序列,DNA序列全长1599 bp,含有2个内含子。本研究的主要结果如下:1.根据已知中国野生葡萄抗白粉病相关新基因VpRFL1基因序列,设计一对特异PCR引物,通过PCR方法,扩增出一条约1053 bp的DNA条带,经克隆测序,序列完全一致。将目的基因构建重组原核表达载体pGEX-VpRFL1,经双酶切鉴定,目的基因与表达载体均正确连接,重组表达载体构建成功。2.重组原核表达载体pGEX-VpRFL1转入大肠杆菌E.coli BL21(coden plus)中,经诱导培养后,重组菌特异性表达了在SDS-PAGE上显示大小约为64 kDa的融合蛋白,说明VpRFL1基因全长在E.coli BL21(coden plus)中得到表达。通过诱导剂IPTG不同浓度诱导对照、不同诱导培养时间对照以及不同诱导培养温度对照,确定了最佳表达条件(37℃,0.1 mM IPTG诱导表达7 h)。3.根据已知中国野生葡萄抗白粉病相关新基因VpRFL1基因序列,设计一对特异PCR引物,通过PCR方法,扩增出一条约1053 bp的DNA条带,经克隆测序,序列完全一致。通过KpnI和SalI双酶切,将VpRFL1基因全长构建到过量表达载体PWRII中,双酶切鉴定表明,成功构建了中国野生葡萄的VpRFL1基因植物过量表达载体。4.以农杆菌介导的花序浸沾法转化拟南芥,获得了潮霉素抗性株系9株。PCR检测潮霉素抗性株系中2个为阳性株系。转基因植株和野生植株在形态上有一定的差异,推测葡萄VpRFL1基因在拟南芥中表达对其生长发育有一定影响。5.构建VpRFL1/PBI221-GFP瞬时表达载体,基因枪转化洋葱表皮细胞,暗培养24h后于共聚焦显微镜下观察该转录因子在细胞中的定位。亚细胞定位结果表明转录因子基因VpRFL1主要定位于细胞核。VpRFL1的序列特征与定位分析初步表明其在核内行使功能,推测该转录因子基因首先是在转录水平上发挥作用。

华东葡萄抗白粉病转录因子基因VpRFL1的结构和亚细胞定位分析

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