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欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的原核表达与单克隆抗体的研制

作　者: 王晓丰
导　师: 姜平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒 核衣壳蛋白 原核表达 单克隆杭体
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)于1987年在美国首次被发现,临床主要表现为怀孕母猪的繁殖障碍和新生仔猪的呼吸道疾病。病原PRRSV属尼多病毒目动脉炎病毒科,是一种有囊膜的单股正链RNA病毒.PRRSV基因组大小约为15kb,含有9个开放阅读框(ORFs),其中ORF7编码的核衣壳蛋白(N蛋白)作为病毒粒子中含量最高、免疫原性最强的结构蛋白之一,对于PRRS的诊断及监控防治具有重要意义。本研究选取欧洲型PRRSV SS-6毒株为研究对象,在克隆并鉴定该病毒N蛋白基因的基础上,进行N蛋白的原核表达,并利用表达的重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,为建立有效的欧洲型PRRSV检测方法以及N蛋白结构和功能研究奠定基础。1.欧洲型PRRSV N蛋白基因的克隆及原核表达根据GenBank中欧洲型PRRSV标准毒株(LV)ORF7基因序列设计了3条引物,且在其中两条引物上分别设计了EcoRI和XhoI酶切位点,以此引物扩增PRRSV SS-6毒株的N蛋白基因。将获得的PCR产物用EcoR I和Xho I酶切后与经同样处理的pGEX-6p-1原核表达载体进行连接,转化DH5α细胞后挑取阳性克隆。经酶切鉴定和测序验证后,将重组质粒pGEX-N转化至E. coli BL-21中,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明,重组质粒在大肠杆菌中得到了高效表达,重组N蛋白分子量大小约为40kDa。免疫印迹试验结果显示,以融合表达的重组N蛋白免疫小鼠制备的抗血清能够与超速离心纯化的欧洲型PRRSV发生特异性反应,证明所表达的蛋白具有PRRSV抗原性.2.欧洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体的制备取纯化的重组GST-N蛋白免疫6～8周龄Balb／c小鼠,分离其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA方法筛选阳性克隆,并采用有限稀释法对其进行亚克隆,经过3次亚克隆获得1株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为1B6,将其连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。亚型鉴定结果为IgGl型,其轻链为κ链；间接免疫荧光试验和免疫印迹试验均证明,1B6单抗既能与欧洲型PRRSV反应,也能与美洲型PRRSV反应；ELISA检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1：640,腹水的效价为1：256000。本研究为欧洲型PRRSV N蛋白结构和功能研究提供了有用工具。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学及单克隆抗体研究进展  10-28
  1. PRRSV分子生物学研究进展  11-16
    1.1 PRRSV基因组结构  11
    1.2 PRRSV基因组编码的蛋白  11-15
    1.3 PRRSV的遗传变异  15-16
  2. PRRSV单克隆抗体的研究进展  16-22
    2.1 主要结构蛋白单抗  16-19
    2.2 次要结构蛋白单抗  19-20
    2.3 非结构蛋白单抗  20-22
  参考文献  22-28
第二章 欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达  28-42
  1. 材料与方法  29-35
    1.1 材料  29
    1.2 方法  29-35
  2. 结果  35-37
    2.1 目的基因的RT-PCR扩增  35
    2.2 重组质粒PGEX-N的构建与酶切鉴定  35-36
    2.3 N蛋白基因的序列测定与分析  36
    2.4 蛋白的诱导表达与纯化  36-37
    2.5 重组蛋白的WESTERN BLOTTING分析  37
  3. 讨论  37-39
  参考文献  39-42
第三章 欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的研制  42-54
  1. 材料与方法  43-46
    1.1 材料  43
    1.2 方法  43-46
  2. 结果  46-48
    2.1 杂交瘤细胞株的建立  46
    2.2 单抗的鉴定  46-48
  3. 讨论  48-51
  参考文献  51-54
全文总结  54-56
致谢  56-58
附录  58-61

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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