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湖羊早期妊娠诊断免疫胶体金层析试纸条的初步研制

作　者: 许欣
导　师: 王锋
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 湖羊 早期妊娠诊断 胶体金免疫层析法 半定量检测 胶体金 孕酮单克隆杭体
分类号: S858.26
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


在妊娠早期,母畜外周血浆中的孕酮含量远远高于发情期,所以可以通过测定血液中的孕酮含量来进行早期妊娠诊断。传统的测定方法主要有放射免疫测定法(RIA),酶免疫测定法(EIA)和乳胶凝集测定试验(LAIT),但是由于操作比较复杂,所以并未得到广泛的应用。胶体金免疫层析技术是20世纪90年代在免疫渗滤技术基础上建立的一种简易快速的免疫检测技术,其检测结果通过肉眼即可判断。这种技术具有操作简便,操作时间短等优点,已经广泛地应用于食品安全和激素的检测。本试验采用胶体金免疫层析技术,根据试验确立的湖羊妊娠孕酮临界值,应用竞争法研制出一种胶体金免疫层析试纸条；通过对配种后21d左右湖羊血液中的孕酮进行半定量测定,进行早期妊娠诊断,具有很好的应用价值。试验的主要内容包括以下3个部分：1.对85头配种后21 d左右未出现返情的湖羊采用放射免疫测定法(RIA)测定其外周血中的孕酮含量。研究结果表明,妊娠羊的孕酮含量为2.33±0.70ng/mL,未妊娠羊的孕酮含量为1.24±0.33ng/mL,怀孕羊的孕酮水平高于未怀孕羊,且差异显著(P<0.05)。设定孕酮含量大于1.7ng/mL为妊娠,低于1.5ng/mL为未妊娠,介于两者之间为疑似怀孕。根据上述标准,妊娠确诊率为100%,未妊娠确诊率为82.61%,疑似妊娠确诊率为64%。2.为了获得高质量的金标孕酮单抗,通过采用柠檬酸三钠还原法制备出符合要求的30 nm的胶体金溶液,在此基础上摸索胶体金标记孕酮单克隆抗体的最佳条件,并对其进行质量鉴定。用柠檬酸三钠还原法制备的30 nm胶体金溶液呈深红色,透射电镜观察,胶体金颗粒大小基本一致；胶体金标记孕酮单克隆抗体的最低稳定浓度为16μg/mL,最适稳定浓度为19.2μg/mL,最适标记pH为8.5。经电镜观察,制备的金标抗体复合物周围有一层明显的低电子密度晕圈,且其在520 nm处的OD值在0.2～0.4范围内。3.利用胶体金免疫层析技术竞争法原理,根据试验所得的湖羊早孕诊断血液孕酮临界值,用金标孕酮单抗复合物为探针制成金标垫,同时用11α-羟孕酮琥珀酸酯与BSA的偶联物和羊抗小鼠IgG二抗包被硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线,制备了半定量检测孕酮的胶体金免疫层析试纸条。结果采用国产SB-08玻璃纤维膜作为样品垫材料,进口Ahlstrom8964玻璃纤维膜作为金标垫,Millipore135硝酸纤维素(NC)膜作为层析材料制成试纸条。检测线和质控线上的包被浓度分别为1.6mg/mL和1.2mg/mL,金标孕酮单抗按1:2稀释后浸金法制作金标垫。NC膜划线后用3%BSA的封闭液进行封闭。试纸条的特异性、稳定性及重复性良好。临床检测27头湖羊,结果显示,与RIA法的符合率为77.8%,与生产记录进行对比后发现,用试纸条进行诊断的妊娠准确率为83.3%,未妊娠准确率为66.7%。

全文目录


全文摘要  9-11ABSTRACT  11-13缩略语表  13-14文献综述部分  14-26  第一章 羊早期妊娠诊断的方法及免疫胶体金的应用  14-26    1 羊早期妊娠诊断技术的研究进展  14-19      1.1 外部观察法  14      1.2 直肠检查法  14-15      1.3 阴道检查法  15      1.4 公羊试情法  15      1.5 免疫学诊断法  15      1.6 孕酮水平测定法  15-18        1.6.1 放射免疫测定法(RIA)  16        1.6.2 酶免疫测定法(EIA)  16-17        1.6.3 乳胶凝集抑制试验(LAIT)  17        1.6.4 酶联免疫吸附测定法(ELISA)  17-18      1.7 早孕因子诊断法(EPF)  18      1.8 血小板计数法  18      1.9 超声波诊断法  18-19      1.10 腹腔内窥镜检测法  19    2 免疫胶体金技术及其在临床诊断上的应用  19-26      2.1 免疫胶体金技术的背景  19-20      2.2 免疫胶体金技术的原理  20-21      2.3 免疫胶体金技术的特点  21-22      2.4 免疫胶体金技术的应用  22-25        2.4.1 在电镜水平的应用  22        2.4.2 在光镜水平的应用  22        2.4.3 在流式细胞仪中的应用  22        2.4.4 凝集试验  22-23        2.4.5 免疫印迹技术(immunoblotting)  23        2.4.6 斑点金免疫渗滤法(DIGFA)  23-24        2.4.7 胶体金免疫层析法(GICA)  24-25      2.5 胶体金免疫技术存在的问题及展望  25-26试验研究部分  26-56  第二章 湖羊早孕诊断血样孕酮临界值的确定  26-30    1 材料  26-27      1.1 试验动物  26      1.2 主要试剂及用品  26      1.3 主要仪器及设备  26-27    2 方法  27      2.1 抗凝管的制备  27      2.2 试验羊的采血及处理  27      2.3 指标测定  27        2.3.1 测定原理  27        2.3.2 P_4浓度的测定  27      2.4 数据统计及分析  27    3 结果  27-28    4 讨论  28-30      4.1 样品处理方法的影响  28-29      4.2 局限性分析  29-30  第三章 胶体金溶液及金标孕酮单克隆抗体复合物的制备  30-42    1 材料  30-31      1.1 主要仪器及设备  30-31      1.2 主要试剂  31      1.3 主要试剂配制  31        1.3.1 无Ca~2+Mg~2+PBS  31        1.3.2 硅化液配方  31        1.3.3 1%氯金酸配方  31        1.3.4 5%BSA  31        1.3.5 1%柠檬酸三钠  31        1.3.6 0.2mol/L碳酸钾溶液  31    2 方法  31-35      2.1 玻璃器皿的清洁及硅化处理  31-32      2.2 柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液  32      2.3 柠檬酸三钠加入量的确定  32      2.4 胶体金溶液的质量鉴定  32-33        2.4.1 肉眼观察  32        2.4.2 可见光光谱法  32        2.4.3 透射电镜观察  32-33      2.5 孕酮单克隆抗体(S_3B_3E_1G_1)的标记条件  33-34        2.5.1 胶体金标记蛋白最低稳定浓度与最适稳定量的确定  33        2.5.2 最适标记pH的确定  33-34      2.6 免疫胶体金复合物的制备  34        2.6.1 透析袋预处理  34        2.6.2 孕酮单克隆抗体的纯化  34        2.6.3 金标孕酮单克隆抗体复合物的制备  34        2.6.4 金标记孕酮单克隆抗体复合物的纯化  34      2.7 金标记孕酮单克隆抗体复合物的鉴定  34-35        2.7.1 最高吸收峰检测法  34-35        2.7.2 OD520nm值测定法  35        2.7.3 电镜观察  35    3 实验结果  35-39      3.1 胶体金质量鉴定  35-37        3.1.1 颜色观察  35        3.1.2 可见光光谱法  35-36        3.1.3 透射电镜法  36-37      3.2 胶体金标记孕酮单抗的最低稳定浓度、最适稳定浓度及最适pH  37-38        3.2.1 最低稳定浓度及最适稳定浓度的确定  37-38        3.2.2 最适pH值的确定  38      3.3 金标记孕酮单克隆抗体复合物的鉴定  38-39    4 讨论  39-42      4.1 胶体金制备因素分析  40      4.2 最pH值和最适蛋白标记量的重要性  40      4.3 金标复合物的稳定性  40-42  第四章 胶体金免疫层析试纸条的组装及检测  42-56    1 材料  42-43      1.1 主要仪器及设备  42      1.2 主要试剂  42      1.3 免疫层析材料  42-43    2 方法  43-47      2.1 样品垫的制备  43        2.1.1 样品垫材料的选择  43        2.1.2 样品垫的预处理  43      2.2 金标垫的制备  43-44        2.2.1 金标孕酮单抗最适稀释度的确定  43        2.2.2 金标垫的预处理  43-44        2.2.3 浸金法制备金标垫  44        2.2.4 金标垫的干燥方法  44      2.3 NC膜的划线  44-45        2.3.1 NC膜型号的选择  44        2.3.2 NC膜半抗原与二抗包被量确定  44-45        2.3.3 喷膜  45        2.3.4 封闭液的优化  45      2.4 试纸条的组装  45      2.5 试纸条的结果判定  45-46      2.6 试纸条的性能测定  46        2.6.1 重复性  46        2.6.2 特异性  46        2.6.3 稳定性  46      2.7 试纸条的初步应用  46-47    3 结果  47-50      3.1 样品垫材料的筛选  47      3.2 样品垫处理液配方  47      3.3 金标垫最佳稀释度  47-48      3.4 金标垫最佳处理液及最佳干燥方法  48      3.5 NC膜型号的选择  48      3.6 NC膜上半抗原与二抗的包被量  48-49      3.7 NC膜的封闭  49      3.8 试纸条的检测  49-50        3.8.1 判断标准  49-50        3.8.2 重复性  50        3.8.3 特异性  50        3.8.4 稳定性  50      3.9 初步应用  50    4 讨论  50-56      4.1 样品垫的选择及处理  51      4.2 金标垫的制作  51-52      4.3 NC膜上蛋白的包被  52-53        4.3.1 NC膜的选择  52        4.3.2 划膜环境  52-53        4.3.3 NC膜的蛋白包被量  53        4.3.4 封闭液的选择  53      4.4 试纸条的组装和保存  53      4.5 试纸条的特点及改进方向  53-56参考文献  56-66全文结论  66-68攻读硕士学位期间发表的学术论文  68-70致谢  70

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 羊
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