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鳜生长激素基因克隆、序列分析、原核表达及真核表达载体构建

作　者: 罗小华
导　师: 肖克宇；鲁双庆
学　校: 湖南农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 鳜生长激素原核表达 Western印迹真核表达载体
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本研究选用鳜（Siniperca chuatsi）作为实验材料,从鳜脑垂体中提取总RNA。根据GenBank上大眼鳜GH cDNA序列（收录号:AY155227）设计合成了一对鳜生长激素基因的特异性引物G1和G2,应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术克隆得到鳜生长激素（scGH）cDNA编码区序列,并定向克隆到pUCm-T质粒上。正反向测序结果分析表明:克隆的鳜GH cDNA序列编码区全长615bp,编码204个氨基酸。分子量为23 kD,等电点为7.07;疏水氨基酸占44.12%,亲水氨基酸占32.35%,碱性氨基酸占12.74%,酸性氨基酸占10.78%。将得到的序列与GenBank上大眼鳜等7种鲈形目鱼类GH cDNA序列编码区进行同源性比较,结果显示:8种鲈形目鱼类GH cDNA序列编码区同源性达到92.54%,其编码氨基酸同源性为93.69%。所克隆的序列与其他7种鲈形目鱼类GH-cDNA序列一样,存在4个保守的半胱氨酸,并形成两个二硫键,在C-末端有一个糖基化位点（Asn-Cys-Thr）。证明本实验克隆到的鳜GH cDNA编码区序列是可靠的,将重组质粒命名为pUCm-GH。采用DNA重组技术将已克隆到的鳜生长激素（scGH）cDNA片段定向插入原核表达载体pET-32a（+）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）。经初步筛选后,测序结果证实鳜GH cDNA片段已正确插入重组子。将含有pET-scGH与pET-32a（+）的大肠杆菌BL21（DE3）菌株,分别用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,含pET-scGH的宿主菌表达的融合蛋白分子量约为43 kD,含pET-32a（+）表达的蛋白分子量约为20 kD,分子量大小都与预期相符,融合蛋白表达量占总蛋白的58%。经探索不同诱导条件,认为该蛋白在IPTG终浓度为1.0mmol/L,起始菌浓度OD₆₀₀=0.9,37℃培养4个小时,为表达外源蛋白的最佳条件。表达产物经Western印迹检验,在PVDF膜上呈现出特异性的反应条带,表明鳜GH-cDNA成功克隆并得到正确表达。设计一对特异性引物G3和G4,以重组质粒pUCm-GH为模板,进行PCR扩增得到鳜GH-cDNA片段。采用DNA重组技术将scGH-cDNA定向插入真核表达载体pYES2/CT中,并转化大肠杆菌DH5α。初步鉴定后,测序结果证实scGH cDNA已正确插入了真核表达载体pYES2/CT中,将构建的重组真核表达载体命名为pYE-scGH。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章前言  10-22
  1 鱼类生长激素研究进展  10-16
    1.1 GH/PRL/SL家族  10-11
    1.2 鱼类生长激素的分泌和调节  11-12
    1.3 鱼类生长激素的结构和生物学功能  12-16
      1.3.1 生长激素的分离  12
      1.3.2 生长激素的分子结构  12-13
      1.3.3 生长激素对鱼类的作用  13-15
      1.3.4 生长激素的作用机理  15-16
  2 鱼类生长激素生物活性和定量免疫测定技术的研究  16-18
    2.1 鱼类生长激素生物活性检测技术  16-17
    2.2 鱼类生长激素定量免疫测定技术  17-18
      2.2.1 放射免疫测定技术(radio mimuno assay，RIA)  17-18
      2.2.2 ELISA测定技术  18
  3 鱼类生长激素的基因工程研究  18-20
    3.1 转基因鱼的研究  19
    3.2 重组鱼类GH的研究  19-20
  4 鱼类GH基因多态性研究进展  20-22
第二章鳜生长激素cDNA的克隆及序列分析  22-44
  1 材料与方法  22-29
    1.1 材料  22-24
      1.1.1 实验鱼  22
      1.1.2 主要仪器设备  22-23
      1.1.3 菌株和质粒  23
      1.1.4 主要药品和试剂  23
      1.1.5 主要试剂配制  23-24
      1.1.6 培养基  24
    1.2 方法  24-29
      1.2.1 鳜脑垂体总RNA提取  24-25
      1.2.2 引物设计  25
      1.2.3 cDNA第一链的合成  25
      1.2.4 鳜GH-cDNA片段的获得  25-27
      1.2.5 GH-cDNA片段亚克隆到pUCm-T载体  27-28
      1.2.6 阳性克隆的筛选与鉴定  28-29
  2 结果与分析  29-41
    2.1 鳜GH-cDNA片段的获取  29-30
      2.1.1 总RNA提取结果  29
      2.1.2 PCR扩增产物电泳结果  29-30
    2.2 GH-cDNA片段的克隆  30-31
    2.3 GH-cDNA片段序列分析  31-41
      2.3.1 GH-cDNA及其推导的氨基酸序列  31-32
      2.3.2 同源性分析  32-38
      2.3.3 基于生长激素cDNA序列的分子进化分析  38-39
      2.3.4 鳜生长激素基因cDNA序列与DNA序列差异分析  39-40
      2.3.5 鳜生长激素基因编码的蛋白质性质预测  40-41
  3 讨论  41-43
    3.1 同源性与系统进化分析  41-42
    3.2 鳜生长激素基因cDNA序列与DNA序列差异分析  42-43
  4 小结  43-44
第三章鳜生长激素基因的原核表达  44-57
  1 材料与方法  44-50
    1.1 材料  44-46
      1.1.1 菌株和质粒  44
      1.1.2 主要药品和试剂  44-45
      1.1.3 主要试剂配制  45-46
      1.1.4 培养基  46
    1.2 方法  46-50
      1.2.1 原核表达质粒的构建  46-47
      1.2.2 GH融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达  47
      1.2.3 原核表达产物的SDS-PAGE电泳  47-49
      1.2.4 表达产物的Western印迹分析  49-50
  2 结果与分析  50-54
    2.1 原核表达载体的构建  50-51
    2.2 GH在大肠杆菌中表达产物的SDS-PAGE分析  51-54
    2.3 表达产物的Western blot分析  54
  3 讨论  54-56
  4 小结  56-57
第四章鳜GH基因真核表达载体的构建  57-63
  1. 材料与方法  57-59
    1.1 材料  57
      1.1.1 菌株和质粒  57
      1.1.2 主要药品和试剂  57
    1.2 方法  57-59
      1.2.1 GH-cDNA片段的获得  57-58
      1.2.2 GH-cDNA片段和pYES2/CT质粒的预处理  58
      1.2.3 GH-cDNA片段与pYES2/CT质粒的连接  58
      1.2.4 连接产物的转化  58
      1.2.5 重组真核表达质粒的筛选  58-59
  2. 结果与分析  59-61
    2.1 真核表达质粒的构建  59
    2.2 重组表达质粒的筛选  59-60
    2.3 重组质粒测序结果  60-61
  3. 讨论  61-62
  4. 小结  62-63
结论  63-64
创新与后续工作  64-65
参考文献  65-75
中英文缩写词简表  75-76
附录  76-78
致谢  78-79
作者简介  79

鳜生长激素基因克隆、序列分析、原核表达及真核表达载体构建

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