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脑心肌炎病毒VP1片段基因稳定性、原核表达及应用研究

作　者: 韦鹏建
导　师: 马忠仁
学　校: 西北民族大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 脑心肌炎病毒 结构蛋白VP1 基因稳定性 原核表达 双抗原夹心Elisa
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


脑心肌炎是由脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)引起猪及一些哺乳动物、乃至灵长类动物的脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要临床症状的一种人畜共患急性传染病。它具有重要的公共卫生学意义,近年来引起了国内外学者的重视。其中研究最热门的是VP1基因,因为其表达的蛋白处于脑心肌炎病毒粒子的最表面,其抗原性也是最强的,该蛋白可刺激机体产生具有中和活性的多克隆抗体,是形成病毒受体结合位点的主要成分,同时VP1的氨基酸序列与病毒的致病性密切相关。本研究以ATCC保藏的EMCV毒株在BHK-21细胞上进行稳定性培养,选取原毒(F0),F4,F8,F12,F16,F20提取核酸,扩增VP1片段,构建克隆载体后由上海生工完成测序并进行拼接。用DNAstar软件进行比对分析,结果显示各代次间VP1的碱基突变率为0.3%-1.6%,传代后各代次病毒VP1基因与F0同源性为98.4%-99.7%。氨基酸突变率为0.7%-1.7%,传代后各代次病毒VP1基因与F0同源性为98.3%-99.3%。突变率较低,符合2010年《中华人民共和国药典》的规定。说明EMCV在BHK-21细胞中连续培养VP1基因的遗传学特性稳定,可以应用于疫苗生产中的病毒接种及培养环节。设计引物,从EMCV原始毒株上扩增VP1片段,构建表达载体,通过优化最佳表达条件,实现VP1的可溶性表达,得到的目的产物大小为56kD,经Western Blotting分析,该蛋白可与EMCV抗血清发生特异性结合反应,证明它具有良好的生物学活性和特异性,可用于双抗原夹心Elisa方法的建立。将上述VP1基因重组蛋白进行包被,以灭活后EMCV病毒液标记辣根过氧化物酶,建立双抗原夹心检测抗体Elisa法,对其试剂批内、批间精密度以及热稳定性进行研究,结果显示,建立双抗原夹心检测抗体Elisa法的精密度小于10%,且稳定性良好,特异性高。用所建方法对来自甘肃某两个地区的1475份体检人血和1309份猪血进行检测,结果这两地区正常人群血清抗体阳性率分别为16.7%和17.0% ,正常猪血清3月龄以下抗体阳性率为56.4%,3月龄以上抗体阳性率为70.7%,符合文献报道。实验结果表明,EMCV能在BHK-21细胞上进行稳定传代,传代后VP1蛋白基因突变率较低,经优化表达条件实现VP1可溶性表达,得到的蛋白具有良好的生物学活性和特异性,用该蛋白包被,成功建立了稳定性、精密性和特异性良好双抗原夹心Elisa法,所建立的方法对甘肃省健康人群和猪血清样品进行检测。结果发现,在甘肃省存在人和猪的EMCV的感染,且在猪群中感染率较高。由于EMCV属人畜共患传染病病毒,可能会存在种属间交叉感染,在今后的研究和工作中应予以高度重视。

全文目录


项目资金来源  4-5
摘要  5-6
Abstract  6-8
缩略词英文对照表  8-14
第一部分：文献综述  14-23
  1 EMCV 的分子生物学特征  14-17
    1.1 病毒基因组结构  14-17
      1.1.1 病毒的结构蛋白及功能  15-16
      1.1.2 病毒的非结构蛋白及其功能  16-17
    1.2 病毒蛋白的裂解  17
  2 EMCV 的理化特性  17-18
  3 EMCV 的致病性  18-19
  4 EMCV 感染的临床症状及病理变化  19-20
  5 EMC 的流行情况及特点  20
  6 EMC 的诊断  20-21
  7 EMC 的防治  21-22
  8 本论文研究目的与意义  22-23
第二部分：实验研究  23-56
  第一章：EMCV 连续培养VP1 基因稳定性  23-34
    1 材料及仪器设备  23-24
      1.1 主要材料  23
      1.2 主要试剂  23
      1.3 主要仪器设备  23-24
      1.4 主要溶液及培养基  24
    2 实验步骤及方法  24-28
      2.1 EMCV 在细胞上的适应性培养及连续传代  24-25
        2.1.1 病毒复融  24
        2.1.2 适应性培养  24-25
          2.1.2.1 毒液的稀释  24
          2.1.2.2 细胞处理  24-25
          2.1.2.3 细胞接毒  25
          2.1.2.4 连续传代  25
      2.2 EMCV-VP1 基因的克隆  25-28
        2.2.1 引物设计与合成  25
        2.2.2 病毒核酸的提取  25-26
        2.2.3 逆转录  26
        2.2.4 套式 PCR 扩增  26-27
        2.2.5 目的基因 PCR 产物的纯化与回收  27
        2.2.6 目的基因与pMD-18T 载体的连接  27
        2.2.7 连接物的转化、单克隆  27-28
        2.2.8 质粒 DNA 的提取  28
        2.2.9 序列测定  28
    3 结果  28-33
      3.1 细胞培养  28-29
      3.2 EMCV-VP1 基因的 PCR 扩增  29-30
      3.3 PCR 产物的纯化与回收验证  30
      3.4 质粒DNA 的提取  30-31
      3.5 序列测定结果  31-33
        3.5.1 VR-129 株与X74312 序列比对  31
        3.5.2 各代次序列比对  31-33
    4 小结与分析  33-34
  第二章：结构蛋白 VP1 基因的克隆与表达  34-47
    1 材料及仪器设备  34-35
      1.1 主要材料  34
      1.2 主要试剂  34-35
      1.3 主要仪器设备  35
      1.4 主要溶液及培养基  35
    2 方法  35-40
      2.1 引物设计与合成  35-36
      2.2 PCR 扩增  36
      2.3 目的基因PCR 产物的纯化与回收  36
      2.4 克隆载体的构建  36-37
        2.4.1 目的基因与pMD-18T 载体的连接  36
        2.4.2 转化与单克隆  36
        2.4.3 质粒 DNA 的提取  36-37
      2.5 重组载体的构建  37-38
        2.5.1 目的片段和载体酶切  37
        2.5.2 目的基因与载体 DNA 的连接  37
        2.5.3 转化与单克隆  37
        2.5.4 质粒 DNA 的提取  37-38
      2.6 重组载体的鉴定  38
        2.6.1 酶切鉴定  38
        2.6.2 PCR 鉴定  38
      2.7 重组蛋白可溶性表达条件的优化  38-39
        2.7.1.诱导温度的选择  39
        2.7.2 IPTG 浓度的选择  39
        2.7.3 诱导时间的选择  39
      2.8 EMCV-VP1 的诱导表达  39-40
      2.9 表达蛋白的Western-Blotting 鉴定  40
    3 结果  40-46
      3.1 EMCV-VP1 基因的 PCR 扩增结果  40
      3.2 EMCV-VP1 纯化与回收验证  40-41
      3.3 质粒DNA 的提取  41-42
      3.4 重组载体的鉴定  42-43
      3.5 重组蛋白质可溶性表达条件的优化  43-45
        3.5.1 诱导温度对表达的影响  43
        3.5.2 IPTG 浓度对表达的影响  43-44
        3.5.3 诱导时间对表达的影响  44-45
      3.6 重组蛋白的诱导表达  45
      3.7 重组蛋白的Western blotting 鉴定  45-46
    4 小结与分析  46-47
  第三章：双抗原夹心 Elisa 法的建立及初步应用  47-56
    1 材料及仪器设备  47-48
      1.1 主要材料  47
      1.2 主要试剂  47
      1.3 主要仪器设备  47
      1.4 主要溶液  47-48
    2 方法  48-50
      2.1 酶标抗原制备  48
      2.2 双抗原夹心Elisa 法建立  48-49
        2.2.1 包被浓度确定  48
        2.2.2 封闭液选择  48-49
        2.2.3 酶标抗原稀释度确定  49
        2.2.4 阴阳性对照  49
      2.3 建立内部参考品  49
        2.3.1 血清筛选及灭活  49
        2.3.2 内部参考品阴阳性确立  49
      2.4 双抗原夹心Elisa 法试剂质量评价  49-50
        2.4.1 精密性  49-50
        2.4.2 稳定性  50
        2.4.3 与间接 Elisa 法试剂比较  50
      2.5 双抗原夹心Elisa 法应用  50
    3 结果  50-54
      3.1 EMCV 抗原包被浓度确定  50
      3.2 封闭液选择结果  50-51
      3.3 酶标抗原工作浓度的确定  51
      3.4 内部参考品阴阳性确定  51-52
      3.5 精密度实验  52-53
      3.6 稳定性实验  53
      3.7 与间接法Elisa 试剂的比较结果  53-54
      3.8 双抗原夹心Elisa 法初步应用  54
    4 小结与分析  54-56
第三部分：结论  56-57
  1 EMCV-VP1 基因稳定性  56
  2 EMCV-VP1 可溶性表达  56
  3 双抗原夹心 Elisa 法的建立及应用  56-57
参考文献  57-63
致谢  63-64
作者简介  64
  硕士期间已发表论文  64
  硕士期间参与的课题研究  64

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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