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PML（NLS~-）基因对白血病细胞HL-60的生物学功能影响

作　者: 高远梅
导　师: 刘北忠
学　校: 重庆医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: PML(NLS-) 重组腺病毒 K562细胞 细胞增殖 PML(NLS~-)基因 白血病 HL-60细胞 凋亡 shRNA 增殖
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


第一部分重组腺病毒Ad-PML(NLS~-)的构建及其鉴定目的构建携带PML（NLS~-）的腺病毒并观察其对K562细胞增殖的影响。方法以质粒pCMV-HA-PML（NLS~-）为模板,PCR扩增PML（NLS~-）,将产物连接到穿梭质粒pAdTrace-TO4，构建成重组穿梭载体pAdTrace-TO4-PML（NLS~-）；经PmeⅠ酶切，转化入BJ5183感受态细菌，提取质粒，获得同源重组腺病毒质粒pAd-PML（NLS~-）；经PacＩ酶切后转染入AD293细胞，获得重组腺病毒Ad-PML（NLS~-）。用RT-PCR法和Western blotting法检测外源PML（NLS~-）在各组AD293细胞中mRNA和蛋白的表达；将腺病毒感染K562细胞,并用MTT法观察其对细胞增殖能力的影响。结果经过酶切、PCR和测序鉴定，重组腺病毒质粒pAd-PML（NLS~-）构建成功;在AD293细胞中成功包装并扩增腺病毒，滴度可达1x1010pfu/ml；RT-PCR法和Westernblotting法结果显示，Ad-PML（NLS~-）携带的PML（NLS~-）能够在AD293细胞中稳定表达；MTT结果表明，与未感染组和空载病毒组相比，感染重组腺病毒Ad-PML（NLS~-）的K562细胞的增殖有明显的促进作用（P<0.05）。结论成功包装并且扩增重组腺病毒Ad-PML（NLS~-），并且Ad-PML（NLS~-）可以促进K562细胞的增殖水平，PML（NLS~-）可能扮演着促癌基因的角色。第二部分重组腺病毒Ad-PML(NLS~-)对HL-60细胞增殖与凋亡的影响目的探讨PML(NLS~-)对大黄素引起的人HL-60凋亡的影响及其机制。方法将重组腺病毒Ad-PML（NLS~-）和空载病毒Ad-KZ分别感染HL-60细胞。RT-PCR法和Western-blot法检测各组细胞PML(NLS~-)基因mRNA和蛋白的表达水平；MTT法分析细胞增殖能力；各组感染HL-60细胞经80μmol／L大黄素处理后，FCM法分析细胞周期分布和凋亡率；并用RT-PCR法和Western blot法分别检测各组细胞凋亡相关基因C-MYC、BCL-2和BAX的mRNA及蛋白表达水平。结果与正常对照组和空载病毒组比较，RT-PCR和Western-blot结果显示，Ad-PML（NLS~-）组细胞内的PML（NLS~-）表达水平明显增高。各组细胞经大黄素处理后，MTT结果显示，感染Ad-PML（NLS~-）的HL-60细胞增值能力明显提高；FCM结果显示，感染Ad-PML（NLS~-）的HL-60细胞处于G1期细胞比例降低,S期细胞比例显著增高（P<0.05），且凋亡率显著降低(P<0.05)；细胞内BCL-2和C-MYC基因mRNA的转录和蛋白表达水平明显增高，BAX基因mRNA的转录水平和蛋白表达水平均明显下降。结论过表达PML(NLS~-)基因能够促进HL-60细胞的增殖，可能通过上调BCL-2和C-MYC基因的表达、下调BAX基因的表达抑制细胞凋亡。第三部分干扰PML（NLS~-）对HL-60细胞增殖与凋亡的影响目的研究干扰缺失核定位信号的PML蛋白PML(NLS~-)对HL-60增殖和凋亡的影响。方法将PML(NLS~-)基因的干扰质粒pGpu6-PML(NLS~-)shRNA和阴性对照质粒pGpu6-NC shRNA转染HL-60细胞，并设空白组。转染后48h，采用半定量RT-PCR法和Western blot法检测各组细胞中PML(NLS~-)基因mRNA和蛋白的表达水平；采用MTT法检测HL-60细胞增殖活力；流式细胞术分析细胞周期及凋亡的变化。结果干扰组的PML（NLS~-）基因mRNA和蛋白质的表达与阴性对照组和空白组相比明显减低（P<0.05）；干扰组的HL-60细胞增殖水平与阴性对照组和空白组相比降低（P<0.05），以48h降低最为显著（P<0.01）；抑制PML(NLS~-)可引起HL-60细胞S期比例增高，G1和G2期细胞比例下降（P<0.05）；干扰组细胞凋亡率明显高于阴性对照组和空白组（P<0.05）。结论抑制PML(NLS~-)的表达，可促进HL-60细胞的凋亡，抑制其增殖。

全文目录


英汉缩略语名词对照  5-6
摘要  6-9
ABSTRACT  9-13
前言  13-14
第一部分 重组腺病毒 AD- PML(NLS-)的构建及其鉴定  14-27
  1.材料与方法  14-19
  2.结果  19-24
  3.讨论  24-25
  参考文献  25-27
第二部分 重组腺病毒 AD-PML(NLS-)对 HL-60 增殖 的学位论文">细胞增殖与凋亡的影响  27-38
  1.材料与方法  27-30
  2.结果  30-35
  3.讨论  35-36
  参考文献  36-38
第三部分 干扰 PML（NLS-）对 HL-60 细胞增殖与凋亡的影响  38-48
  1.材料与方法  38-41
  2.结果  41-45
  3.讨论  45-46
  参考文献  46-48
全文总结  48-49
文献综述  49-55
  参考文献  51-55
致谢  55-56
攻读硕士学位期间发表的论文  56-57

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病
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