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自噬抑制剂氯喹刺激ROS产生增强人乳腺癌细胞对3-溴丙酮酸的敏感性

作　者: 张倩雯
导　师: 蒋志文；刘浩
学　校: 蚌埠医学院
专　业: 药理学
关键词: 乳腺癌 3-BrPA CQ 凋亡自噬坏死性凋亡
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：1.探讨3-溴丙酮酸（3-Bromopyruvate，3-BrPA）对人乳腺癌细胞增殖抑制及诱导凋亡的影响，以及3-BrPA诱导人乳腺癌细胞产生自噬。2.探讨氯喹（Chloroquine，CQ）和3-BrPA联合使用对人乳腺癌细胞增殖抑制及诱导细胞死亡的影响，以及对自噬相关蛋白和凋亡相关蛋白表达的影响。3.探讨3-BrPA和CQ联合使用后，人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-435的死亡形式，以及与RIPK1和RIPK3蛋白之间关系。4.探讨3-BrPA处理人乳腺癌细胞后，ROS变化，以及3-BrPA和CQ联合使用后，人乳腺癌细胞死亡与ROS关系。5.探讨CQ是否可以增强3-BrPA体内抗肿瘤作用。方法：1. MTT法首先探讨3-BrPA（20、40、80、160、320μmol·L-1）处理人乳腺癌细胞MDA-MB-435和MDA-MB-23124、36、48h后对细胞存活率的影响，以明确其剂量-效应关系；同时倒置显微镜下拍照，然后观察细胞形态变化。2.首先分别用3-BrPA（320μmol·L-1，160μmol·L-1）处理细胞MDA-MB-435和MDA-MB-23112h后，用电镜观察自噬体形成；接下来采用Western blotting法检测同上法处理后人乳腺癌细胞0、1h、2h、4h、8h、12h后，自噬相关蛋白LC-3和Beclin-1变化。然后将人乳腺癌细胞瞬时转染GFP-LC3质粒，使用激光共聚焦显微镜观察自噬小体形成。3. MTT法探讨3-BrPA和CQ联合使用后，对人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-435存活率的影响，并使用倒置显微镜拍照，观察细胞形态；接下来使用Annexin V/PI双染法流式细胞术检测两药联合使用后对人乳腺癌细胞诱导凋亡的影响；然后，采用Western blotting法检测了两药联合使用后自噬相关蛋白LC-3和Beclin-1以及凋亡相关蛋白Bak, Bax, Bcl-2和Mcl-1变化；最后采用MTT法检测敲除自噬相关蛋白Atg7后，3-BrPA （320μmol·L-1）对人乳腺癌细胞MDA-MB-435和3-BrPA （160μmol·L-1）对人乳腺癌细胞MDA-MB-231存活率影响。4.使用caspase抑制剂z-VAD-fmk（10μmol·L-1）预处理人乳腺癌细胞后，采用MTT法检测了3-BrPA（160μmol·L-1）和CQ（20μmol·L-1）联合使用后对细胞存活率的影响，以确定两种细胞死亡形式是不是凋亡；将MDA-MB-231细胞用3-BrPA（160μmol·L-1）和CQ（20μmol·L-1）联合处理后，用电镜观察细胞膜形态和细胞内容物变化，进一步确定MDA-MB-231细胞的死亡形式；将两株细胞用RIPK1抑制剂Necrostatin-1（Nec-1,10μmol·L-1）处理后，再联合使用3-BrPA（160μmol·L-1）和CQ（20μmol·L-1），使用MTT法观察细胞存活率，观察Nec-1对两株细胞死亡的影响；最后采用MTT法检测敲除受体相关蛋白-1和-3(Receptor interacting proteinkinase-1/3, RPIK1/3)后，再联合使用3-BrPA（160μmol·L-1）和CQ（20μmol·L-1）对人乳腺癌细胞存活率影响，以明确RIPK1/3与细胞死亡之间关系。5.人乳腺癌细胞MDA-MB-435和MDA-MB-231分别用3-BrPA（320μmol·L-1，160μmol·L-1）和CQ（40μmol·L-1）联合处理后，使用DHE染色，用流式细胞仪检测细胞内ROS水平；接下来用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine,NAC)（5mmol·L-1）预处理细胞1h，再按上述方法处理，使用MTT法检测细胞存活率和倒置显微镜进行拍照以观察细胞形态；同上处理，线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)染色，来观察细胞膜电位变化。6.采用裸鼠荷瘤模型，通过测定成瘤曲线和称量瘤子重量和HE染色，探讨CQ是否可以增强3-BrPA体内抗肿瘤作用。结果：一、3-BrPA对人乳腺癌细胞MDA-MB-435、MDA-MB-231增殖的影响1．MTT法显示不同浓度的3-BrPA对人乳腺癌细胞MDA-MB-231具有增殖抑制作用，且随着3-BrPA浓度的增加和作用时间的延长，3-BrPA对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖抑制作用明显增加，但是不同浓度的3-BrPA对MDA-MB-435的敏感性相对较低，且随着3-BrPA浓度的增加和作用时间的延长，增殖抑制作用没有明显增加。2．倒置显微镜下观察得到，不同浓度3-BrPA处理人乳腺癌细胞MDA-MB-23124h后，细胞密度明显降低，且细胞变圆，而不同浓度3-BrPA处理人乳腺癌细胞MDA-MB-43524h后，细胞密度没有明显变化，仅有少数细胞变圆。二、3-BrPA诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-435、MDA-MB-231发生自噬1．电镜检测结果显示： MDA-MB-435、 MDA-MB-231细胞分别经3-BrPA（320μmol·L-1，160μmol·L-1）处理后，细胞内线粒体肿胀变形，且出现包含有内容物的自噬小体。2． Western blotting法检测自噬相关蛋白LC3、 beclin1的变化，结果显示：MDA-MB-435、MDA-MB-231细胞经3-BrPA处理后，随着时间延长，自噬相关蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化，Beclin1表达增多，表明自噬发生。3．激光共聚焦结果显示：GFP-LC3质粒转染之后，3-BrPA处理使得MDA-MB-435、MDA-MB-231细胞内荧光小点比对照组明显增多，即自噬小体明显增多，表明自噬发生。三、CQ联合3-BrPA对人乳腺癌细胞增殖抑制及诱导凋亡和自噬相关蛋白LC3、Beclin1和凋亡相关蛋白表达的影响1．MTT法结果显示联合使用3-BrPA和CQ之后，细胞存活率比3-BrPA，CQ和对照组明显降低，具有统计学意义；且合用组细胞形态与3-BrPA，CQ和对照组相比，细胞密度明显减少，细胞变圆且漂浮在培养液中。Annexin V/PI双染法流式细胞术检测到，联合使用3-BrPA和CQ之后，细胞凋亡率比3-BrPA，CQ和对照组明显增多，具有统计学意义。2．Western blotting法检测自噬相关蛋白LC3、beclin1的变化，结果显示：联合使用3-BrPA和CQ之后，合用组自噬相关蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化减少，自噬相关蛋白Beclin1表达减少，表明自噬被抑制；同时，Western blotting法检测凋亡相关蛋白，合用组的抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2表达减少，促凋亡蛋白Bax和Bak表达增多，表明凋亡发生；3.最后采用MTT法检测敲除自噬相关蛋白Atg7后，再使用3-BrPA处理组同单用3-BrPA处理组比较，可见细胞存活率明显降低，表明抑制自噬可以增强人乳腺癌细胞对3-BrPA的敏感性。四、联合使用3-BrPA和CQ诱导MDA-MB-435细胞产生RPIK1依赖的凋亡，MDA-MB-231细胞产生依赖RPIK1/3的坏死性凋亡1. MTT法结果显示使用caspase抑制剂z-VAD-fmk（10μmol·L-1）后，MDA-MB-435细胞联合使用3-BrPA和CQ的细胞存活率明显增加，然而对MDA-MB-231的细胞存活率影响并不大；将MDA-MB-231细胞用3-BrPA和CQ联合处理后再用电镜观察，发现联合用药组细胞器膨胀，细胞内容物外泄，呈现坏死特征；接下来将两株细胞同时使用RPIK1抑制剂Nec-1，MTT结果发现Nec-1同3-BrPA和CQ联用细胞存活率比只3-BrPA和CQ联用细胞存活率明显增多；最后，将两株细胞同时敲除RPIK1/3，MTT结果发现敲除RPIK1/3后再联合使用3-BrPA和CQ，同只联合使用3-BrPA和CQ相比，MDA-MB-231细胞存活率明显增多，而敲除RPIK3后，对MDA-MB-435细胞影响很少。五、ROS产生导致了联合使用3-BrPA和CQ诱导的乳腺癌细胞死亡1.流式细胞仪检测得到，MDA-MB-435细胞3-BrPA（320μmol·L-1）MDA-MB-435细胞3-BrPA（160μmol·L-1）分别处理6h后，同对照组相比，细胞内ROS水平明显增高，并且分别和CQ（40μmol·L-1）联合用药组细胞内ROS水平也明显增高。接下来，MTT结果表明ROS清除剂NAC可以挽救3-BrPA和CQ联合用药诱导的细胞死亡。使用倒置显微镜进行观察可以看到，同3-BrPA和CQ联合用药组比起来，NAC和3-BrPA和CQ联合用药组细胞密度明显变大，且细胞形态也基本恢复正常。2.最后使用荧光显微镜观察使用了JC-1染色后，细胞膜电位的变化。3-BrPA和CQ联合用药组细胞同对照组细胞相比，JC-1红光减弱，绿光增强，表明细胞由红光向绿光转变，说明细胞发生早期凋亡。相反，NAC（5mmol·L-1）同3-BrPA和CQ联合用药组细胞发生了JC-1红光增强，绿光减弱，表明NAC可以保护细胞不受3-BrPA和CQ联合诱导的细胞死亡的影响。六、CQ可以增强3-BrPA体内抗肿瘤效果1.为了明确CQ是否可以增强3-BrPA体内抑制肿瘤生长的能力，使用了人乳腺癌细胞MDA-MB-231异种移植瘤裸鼠模型。裸鼠成瘤曲线表明：3-BrPA和CQ合用组的肿瘤生长曲线同其他三组比起来曲线比较平缓，且肿瘤体积较小。最后颈椎脱臼处死小鼠，称量瘤体湿重，对照组平均瘤重为2.9g，3-BrPA组平均瘤重为2.1g，CQ组平均瘤重为2.0g，3-BrPA和CQ合用组平均瘤重为1.2g，抑瘤率分别为27.58%，31.0%，58.6%。HE染色结果表明，在肿瘤最外层血管最丰富处，3-BrPA和CQ合用组同其他组比起来，正常区域较少，而坏死区域较多。结论：1.3-BrPA对人乳腺癌细胞MDA-MB-231具有增殖抑制作用，且随着浓度的加大，细胞存活率随之降低，但MDA-MB-435细胞对3-BrPA不敏感。作用机制可能与3-BrPA所诱发的自噬的保护作用相关。2.3-BrPA可以诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-435、MDA-MB-231发生自噬。3.自噬抑制剂同3-BrPA联合使用，可诱导乳腺癌细胞死亡。对于MDA-MB-435，细胞死亡形式为依赖RIPK1蛋白的凋亡，而MDA-MB-231的细胞死亡形式则为依赖RIPK1/3蛋白的坏死性凋亡。4.3-BrPA同CQ联合使用诱导的细胞死亡是由刺激细胞内ROS产生引起的。5. CQ可以增强3-BrPA的体内抗肿瘤能力。

全文目录

目录  4-6
中文摘要  6-10
Abstract  10-17
引言  17-18
材料与方法  18-28
  1. 材料与仪器  18-20
  2. 实验方法  20-28
  3. 统计学处理  28
结果  28-38
  （一）3-BrPA 对人乳腺癌细胞增殖的影响  28-29
  （二）3-BrPA 诱导人乳腺癌 MDA-MB-435 和 MDA-MB-231 细胞发生自  29-31
  （三）抑制自噬增强 3-BrPA 诱导人乳腺癌 MDA-MB-435 、MDA-MB-231 细胞死亡的作用  31-33
  （四）3-BrPA 和 CQ 联合使用诱导乳腺癌 MDA-MB-435 细胞发生依赖于 RIPK1 的凋亡，而诱导乳腺癌 MDA-MB-231 细胞发生依赖于RIPK1/3 的坏死性凋亡  33-35
  （五）3-BrPA 和 CQ 联合使用诱导乳腺癌 MDA-MB-435 细胞和MDA-MB-231 细胞死亡是通过刺激细胞内 ROS 产生的  35-37
  （六）CQ 可以增强 3-BrPA 体内抗肿瘤效果  37-38
讨论  38-40
结论  40
参考文献  40-44
致谢  44-45
附录  45-61
  附录A 英中文术语缩略语对照表  45-46
  附录B 主要试剂配制方法  46-50
  附录C 个人简历及发表论文  50-51
  附录D 综述  51-61

自噬抑制剂氯喹刺激ROS产生增强人乳腺癌细胞对3-溴丙酮酸的敏感性

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