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干扰TIGAR基因增强肝癌细胞对表阿霉素化疗敏感性的机制研究
作 者: 李斌
导 师: 吴浩荣
学 校: 苏州大学
专 业: 外科学
关键词: TIGAR RNAi 表阿霉素 凋亡 自噬
分类号: R735.7
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
目的:探讨干扰TIGAR基因在体外增强肝癌细胞HepG2对表阿霉素化疗敏感性的机制。方法:噻唑蓝(MTT)检测表阿霉素(Epi)对HepG2细胞的增殖抑制和IC50;Western blot检测表阿霉素对HepG2细胞内相关蛋白表达的影响;化学合成双链TIGAR siRNA1/2,检测其干扰效率;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测干扰TIGAR基因联合表阿霉素诱导细胞凋亡率,Western blot检测细胞内自噬和凋亡相关蛋白水平;2’,7’-二氯二氢荧光素双醋酸盐(DCFH2-DA)探针标记流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平;应用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、广泛性Caspases抑制剂(Z-VAD-FMK)和3-甲基腺嘌呤(3-MA)三个工具药分别降低细胞内活性氧的水平、抑制Caspases激活和自噬激活,检测细胞凋亡率和相关蛋白水平。结果:MTT结果显示表阿霉素对HepG2细胞增殖具有明显抑制作用,细胞增殖抑制率随着时间延长和药物浓度的增加而升高,表阿霉素作用12小时,IC50为78.14±3.27μg/ml;Western blot检测显示不同药物浓度作用12小时和同一药物浓度(5μg/ml)作用不同时间,细胞内p53、PUMA、TIGAR表达上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的水平下调,Bcl-2表达无明显变化。TIGAR siRNA1/2干扰效率大于85%(*** p<0.001);流式细胞术结果显示,干扰TIGAR基因联合表阿霉素组细胞凋亡率明显高于对照组(*P<0.05),并且该组细胞内活性氧水平、Caspase-3激活水平和自噬水平均明显高于对照组(*P<0.05)。应用NADPH降低活性氧水平和Z-VAD-FMK抑制Caspase-3激活后,细胞凋亡率明显降低;应用3-MA抑制自噬后,细胞凋亡率明显升高。结论:干扰TIGAR基因能增强肝癌细胞HepG2对表阿霉素的化疗敏感性,其凋亡机制涉及细胞内氧化应激、Caspase-3介导细胞凋亡途径的激活和自噬激活途径三条信号通路。
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全文目录
中文摘要 4-6 Abstract 6-10 研究背景 10-17 第一部分 表阿霉素对肝癌细胞HepG2 增殖抑制影响和对细胞内自噬、凋亡相关蛋白以及TIGAR 表达的影响 17-32 一 表阿霉素对体外培养的人肝癌细胞HepG2 的增殖抑制 17-24 材料与方法 17-21 实验结果 21-22 讨论 22-24 小结 24 二 表阿霉素对细胞内自噬、凋亡相关蛋白和TIGAR 表达的影响 24-32 材料和方法 24-27 实验结果 27-29 讨论 29-31 小结 31-32 第二部分 RNAi 技术干扰TIGAR 基因干扰率的测定和干扰TIGAR 基因联合表阿霉素对肝癌细胞HepG2 凋亡率的影响 32-39 材料和方法 32-35 实验结果 35-37 讨论 37-38 小结 38-39 第三部分 氧化应激、Caspases 激活和自噬激活三条途径探讨凋亡机制 39-55 一 细胞内ROS 水平检测和NADPH 降低ROS 后细胞凋亡率的测定 39-44 材料与方法 39-41 实验结果 41-43 讨论 43-44 小结 44 二 凋亡相关蛋白测定和Z-VAD-FMK 抑制Caspases 激活细胞凋亡率的测定 44-49 材料与方法 45-46 实验结果 46-48 讨论 48-49 小结 49 三 自噬相关蛋白测定和3-MA 抑制自噬激活细胞凋亡率的测定 49-55 材料与方法 49-51 结果 51-52 讨论 52-54 小结 54-55 讨论 55-60 全文结论 60-61 参考文献 61-65 综述:TIGAR 蛋白—肿瘤早期诊断和治疗的新靶标 65-74 参考文献 71-74 缩略词表 74-75 攻读学位期间公开发表的论文 75-76 致谢 76-77
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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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