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干扰TIGAR基因增强肝癌细胞对表阿霉素化疗敏感性的机制研究

作 者: 李斌
导 师: 吴浩荣
学 校: 苏州大学
专 业: 外科学
关键词: TIGAR RNAi 表阿霉素 凋亡 自噬
分类号: R735.7
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 12次
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内容摘要


目的:探讨干扰TIGAR基因在体外增强肝癌细胞HepG2对表阿霉素化疗敏感性的机制。方法:噻唑蓝(MTT)检测表阿霉素(Epi)对HepG2细胞的增殖抑制和IC50;Western blot检测表阿霉素对HepG2细胞内相关蛋白表达的影响;化学合成双链TIGAR siRNA1/2,检测其干扰效率;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测干扰TIGAR基因联合表阿霉素诱导细胞凋亡率,Western blot检测细胞内自噬和凋亡相关蛋白水平;2’,7’-二氯二氢荧光素双醋酸盐(DCFH2-DA)探针标记流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平;应用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、广泛性Caspases抑制剂(Z-VAD-FMK)和3-甲基腺嘌呤(3-MA)三个工具药分别降低细胞内活性氧的水平、抑制Caspases激活和自噬激活,检测细胞凋亡率和相关蛋白水平。结果:MTT结果显示表阿霉素对HepG2细胞增殖具有明显抑制作用,细胞增殖抑制率随着时间延长和药物浓度的增加而升高,表阿霉素作用12小时,IC50为78.14±3.27μg/ml;Western blot检测显示不同药物浓度作用12小时和同一药物浓度(5μg/ml)作用不同时间,细胞内p53、PUMA、TIGAR表达上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的水平下调,Bcl-2表达无明显变化。TIGAR siRNA1/2干扰效率大于85%(*** p<0.001);流式细胞术结果显示,干扰TIGAR基因联合表阿霉素组细胞凋亡率明显高于对照组(*P<0.05),并且该组细胞内活性氧水平、Caspase-3激活水平和自噬水平均明显高于对照组(*P<0.05)。应用NADPH降低活性氧水平和Z-VAD-FMK抑制Caspase-3激活后,细胞凋亡率明显降低;应用3-MA抑制自噬后,细胞凋亡率明显升高。结论:干扰TIGAR基因能增强肝癌细胞HepG2对表阿霉素的化疗敏感性,其凋亡机制涉及细胞内氧化应激、Caspase-3介导细胞凋亡途径的激活和自噬激活途径三条信号通路。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-10
研究背景  10-17
第一部分 表阿霉素对肝癌细胞HepG2 增殖抑制影响和对细胞内自噬凋亡相关蛋白以及TIGAR 表达的影响  17-32
  一 表阿霉素对体外培养的人肝癌细胞HepG2 的增殖抑制  17-24
    材料与方法  17-21
    实验结果  21-22
    讨论  22-24
    小结  24
  二 表阿霉素对细胞内自噬、凋亡相关蛋白和TIGAR 表达的影响  24-32
    材料和方法  24-27
    实验结果  27-29
    讨论  29-31
    小结  31-32
第二部分 RNAi 技术干扰TIGAR 基因干扰率的测定和干扰TIGAR 基因联合表阿霉素对肝癌细胞HepG2 凋亡率的影响  32-39
  材料和方法  32-35
  实验结果  35-37
  讨论  37-38
  小结  38-39
第三部分 氧化应激、Caspases 激活和自噬激活三条途径探讨凋亡机制  39-55
  一 细胞内ROS 水平检测和NADPH 降低ROS 后细胞凋亡率的测定  39-44
    材料与方法  39-41
    实验结果  41-43
    讨论  43-44
    小结  44
  二 凋亡相关蛋白测定和Z-VAD-FMK 抑制Caspases 激活细胞凋亡率的测定  44-49
    材料与方法  45-46
    实验结果  46-48
    讨论  48-49
    小结  49
  三 自噬相关蛋白测定和3-MA 抑制自噬激活细胞凋亡率的测定  49-55
    材料与方法  49-51
    结果  51-52
    讨论  52-54
    小结  54-55
讨论  55-60
全文结论  60-61
参考文献  61-65
综述:TIGAR 蛋白—肿瘤早期诊断和治疗的新靶标  65-74
  参考文献  71-74
缩略词表  74-75
攻读学位期间公开发表的论文  75-76
致谢  76-77

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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