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绞股蓝有效部位对SAMP8小鼠抗老年性痴呆作用及其机制研究

作　者: 吴燕春
导　师: 钟振国
学　校: 广州中医药大学
专　业: 中药学
关键词: 绞股监有效部位抗老年性痴呆(抗AD) SAM小鼠 NG-108细胞株 Aβ
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：研究绞股蓝有效部位对快速性老化痴呆小鼠(SAMP8小鼠)抗老年性痴呆(AD)作用及其机制。对中药绞股蓝提取分离出的部位进行体外抗老年性痴呆筛选,确定其有效部位后,进行体内实验,探究绞股蓝对SAMP8小鼠的抗AD作用及机制,为绞股蓝抗老年性痴呆作用提供实验信息及科学依据。方法：1.绞股蓝的提取、分离：将干燥的绞股蓝全草制成粗粉,称取25.0kg,分别用95%、70%、50%乙醇浸渍提取3次,每次浸泡4-5d,合并提取液,减压回收乙醇。得乙醇总提取物后用水溶解成混悬液,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,回收溶剂。2.(1)对中药绞股蓝有效部位进行体外筛选：采用MTT法,体外直接给药测定绞股蓝有效部位对NG-108细胞增殖的影响,用Aβ25-35片段损伤NG-108细胞,造成体外AD模型,测定绞股蓝有效部位对小鼠NG-108细胞的增殖作用,通过两种方式,在药效试验跟踪下,从中筛选出药效较强的有效部位。(2)体外抗老年性痴呆的作用研究：采用MTT法,直接加药和含药血清检测绞股蓝有效部位(正丁醇部位)对Aβ25-35片段造成NG-108细胞的损伤的体外AD模型的增殖作用：用Hoechst33258染色法、流式细胞法观察正丁醇部位对Aβ25-35造成NG-108细胞损伤作用的影响,采用Elisa法检测半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表达水平。3.体内抗老年性痴呆作用研究：采用健康正常老化小鼠(SAMR1小鼠)10只和快速性老化痴呆模型小鼠模型(SAMP8小鼠)50只,随机把SAMP8小鼠分为SAMP8模型组、阳性对照组(石杉碱甲0.15mg/kg);绞股蓝正丁醇部位高剂量组(500mg/kg);绞股蓝正丁醇部位中剂量组(250mg/kg);绞股蓝正丁醇部位低剂量组(125mg/kg);每组10只小鼠。石杉碱甲组和各给药组按以上剂量给药,SAMR1组给予等容积的双蒸水,各组均灌胃给药(ig),给药容量均为10mL/kg,每天给药1次,连续给药8周。末次给药后24h,用Morris水迷宫方法以逃避潜伏期、寻求次数和平台停留时间为指标对小鼠记忆行为进行检测,观察中药绞股蓝正丁醇部位对小鼠行为学的影响。采用ELISA法测定SOD、MDA、 GSH、Aβ、细胞色素C的含量。采用免疫组化法检测APP、p75NTR、pJNK及凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2和半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表达水平；采用RT-PCR法对SAMP8大脑中APP、BACE-1、p75NTR、pJNKmRNA进行半定量分析；用Western Blot法测定P53的表达。4.急性毒性试验(最大耐受量Maximaltolerance dose, MTD测定)：取昆明种小鼠20只,体重18-22g,雌雄各半,禁食不禁水12小时后,给予绞股蓝正丁醇部位,以最大浓度和最大体积,灌胃给药(ig)。给药后连续14天观察动物的毒性症状及死亡情况,每间隔7天称重1次。计算MTD的倍数,小鼠体重增加百分率。(小鼠MTD倍数=每只小鼠耐受药量/小鼠平均体重×成人平均体重(60kg)/成人每日用量)。结果：1.实验得到乙醇总提取物9kg。用水溶解成混悬液,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,回收溶剂,得石油醚部位286.1g；乙酸乙酯部位524.0g；正丁醇部位974.2g；水部位1303.0g。2.(1)绞股蓝提取物体外筛选：绞股蓝提取物对体外NG-108细胞增殖的影响：①绞股蓝石油醚部位和正丁醇部位在5～40μg/mL浓度下对NG-108细胞均有明显的增殖作用(P<0.05或P<0.01)。绞股蓝水提部位在5～40μg/mL浓度对NG-108细胞无增殖作用,而在80μg/mL浓度下对NG-108细胞显示有增殖作用(P<0.05)。乙酸乙酯部位对NG-108细胞有增殖趋势,但与空白组比较无显著性意义。②Aβ25-35片段造成NG-108细胞损伤后的对细胞增殖作用的影响：绞股蓝正丁醇部位在5～20μg/mL浓度下对NG-108细胞均有明显的增殖作用(P<0.05)。绞股蓝石油醚部位和水提部位在5μg/mL浓度对NG-108细胞有增殖作用(P<0.05)。而乙酸乙酯部位对NG-108细胞有增殖趋势,但与25μMMol/L Aβ25-35损伤组比较无显著性差异,筛选出绞股蓝正丁醇部位为有效部位。(2)股蓝正丁醇部位体外抗老年性痴呆(AD)作用机制研究：①绞股蓝正丁醇部位对体外Aβ25-35损伤的NG-108细胞增殖的影响：绞股蓝正丁醇部位在5、10μg/mL浓度下对Aβ25-35损伤的NG-108细胞均有比较明显的增殖作用(P<0.01),在20、40μg/mL浓度对Aβ25-35损伤的NG-108细胞有增殖趋势,但与Aβ25-35损伤组比较无显著性意义。②绞股蓝正丁醇部位含药血清对体外Aβ25-35损伤的NG-108细胞增殖的影响：绞股蓝正丁醇部位含药血清对Aβ25-35损伤的NG-108细胞体外生长有促进增殖作用,10%绞股蓝正丁醇部位含药血清与10%空白含药血清比较,有显著性意义(P<0.05)；20%绞股蓝正丁醇部位含药血清对Aβ25-35损伤的NG-108细胞有增殖趋势,但与20%空白含药血清比较,无显著性意义。③Hoechst33258染色：直接给药法表明,绞股蓝正丁醇部位在5、10μg/mL浓度下对Aβ25-35损伤NG-108细胞的凋亡有明显的抑制的作用(P<0.05),20μg/mL浓度下对Aβ25-35损伤NG-108细胞也有一定的抑制作用,但与Aβ25-35损伤组比较无显著性意义；含药血清法表明,绞股蓝正丁醇部位含药血清对Aβ25-35损伤的NG-108细胞凋亡有抑制的作用,10%绞股蓝正丁醇部位含药血清与10%空白含药血清比较,有显著性意义(P<0.05)；20%绞股蓝正丁醇部位含药血清对Aβ25-35损伤的NG-108细胞有增殖趋势,但与20%空白含药血清比较,无显著性意义。④流式细胞法：直接接给药法表明,绞股蓝正丁醇部位在5、10μg/mL浓度下对Aβ25-35损伤NG-108细胞的凋亡有明显的抑制的作用(P<0.05),20μg/mL浓度下对AP25-35损伤NG-108细胞也有一定的抑制作用,但与Aβ25-35损伤组比较无显著性意义。含药血清法表明,绞股蓝正丁醇部位含药血清对Aβ25-35损伤的NG-108细胞凋亡有抑制的作用,10%绞股蓝正丁醇部位含药血清与10%空白含药血清比较,有显著性意义(P<0.05)；20%绞股蓝正丁醇部位含药血清对Aβ25-35损伤的NG-108细胞有增殖趋势,但与20%空白含药血清比较,无显著性意义。3.绞股蓝正丁醇部位对快速性老化痴呆模型SAMP8小鼠作用的影响(1) Morris水迷宫学习能力测试：游泳能力测定结果显示,SAMP8模型组和SAMR1组及各给药组之间比较没有显著性差异(P>0.05)。定位航行实验结果显示：①潜伏期：SAMP8模型组的逃避潜伏期与其他各组比明显延长,其他组(除了高剂量组)与SAMP8模型组对比有非常显著性差异(P<0.01),②寻求次数：SAMP8模型组平均寻求次数均少于其他各给药组,其他组(除了高剂量组)与SAMP8模型组对比有显著性的差异(P<0.05)；③平台停留时间：SAMP8模型组平均停留时间比其他给组短,其他组(除了高剂量组)与对比SAMP8模型组在统计学上无显著差异外,都有显著性的差异(P<0.05)。(2)绞股蓝正丁醇部位对老年性痴呆小鼠体内自由基代谢的影响：②SOD: SAMR1组、石杉碱甲组、中剂量组和低剂量与SAMP8模型组相比有非常显著性差异(P<0.O1)。②GSH-PX:与SAMP8模型组相比,SAMR1组、石杉碱甲组有非常显著性差异(P<0.01), SAMP8模型组与低剂量组相比有显著性差异(P<0.05)。③MDA: SAMR1组、石杉碱甲组和低剂量与SAMP8模型组相比有非常显著性差异(P<0.01),中剂量组与SAMP8模型组相比有显著性差异(P<0.05)。(3)绞股蓝正丁醇部位对老年痴呆小鼠Aβ、APP和BACE-1的影响：①对于血清中Aβ含量的表达,SAMR1组、石杉碱甲组、低剂量组和中剂量与SAMP8模型组相比有非常显著性差异(P<0.01),高剂量与SAMP8模型组相比有显著性差异(P<0.05)。对于脑内Aβ含量的表达,SAMR1组、石杉碱甲组与SAMP8模型组相比有非常显著性差异(P<0.01),低剂量组、中剂量与SAMP8模型组相比有显著性差异(P<0.05)。②绞股蓝正丁醇部位对小鼠脑组织内APP蛋白免疫阳性神经元的影响：APP免疫阳性神经元主要分布于大脑顶叶皮层,海马CA1、CA3和血管内壁等部位。APP免疫阳性神经元个数各组比较：SAMR1组、石杉碱甲组与SAMP8模型比较,有非常显著的差异(P<0.01),低剂量组、中剂量与SAMP8模型组比较亦有显著性差异(P<0.05)。②绞股蓝正丁醇部位对BACE-1、APPmRNA表达的影响：对于BACE-1, SAMR1组与SAMP8模型组相比有非常显著性差异(P<0.01),石杉碱甲组和低剂量与SAMP8模型组相比有显著性差异(P<0.05),对于APPmRNA, SAMR1组与SAMP8模型组相比有非常显著性差异(P<0.01),石杉碱甲组、中剂量组和低剂量与SAMP8模型组相比有显著性差异(P<0.05)。(4)绞股蓝正丁醇部位对老年性痴呆小鼠Aβ介导p75NTR凋亡通路的影响：①绞股蓝正丁醇部位对细胞色素C含量的影响：SAMR1组、石杉碱甲组、低剂量和中剂量组与SAMP8模型组相比有非常显著性差异(P<0.01)。②绞股蓝正丁醇部位对小鼠脑组织内p75NTR、pJNK、Bax、Bcl-2和caspase-3免疫阳性神经元的影响。(1)p75NTR免疫阳性神经元个数各组比较：SAMR1组、石杉碱甲组和低剂量组与SAMP8模型组比较,有非常显著性意义(P<0.01),绞股蓝正丁醇中剂量组与模型组比较,有显著性差异(P<0.05),高剂量与SAMP8模型对照组相比,无显著性差异；(2)pJNK免疫阳性神经元个数各组比较：SAMR1组、石杉碱甲组、低剂量和中剂量组与SAMP8模型比较,有非常显著的差异(P<0.01),绞股蓝正丁醇高剂量组与模型组比较,无显著性差异。(3)Bax免疫阳性神经元个数各组比较：SAMR1、石杉碱甲组和绞股蓝正丁醇高、中、低剂量组与SAMP8模型组比较,有非常显著性意义(P<0.01)；(4)Bcl-2免疫阳性神经元个数各组比较：SAMR1组、石杉碱甲组和绞股蓝正丁醇的低剂量与模型组比较,有非常显著性意义(P<0.01)；绞股蓝正丁醇中剂量与SAMP8模型组比较,有显著性差异(P<0.05)；(5)caspase-3免疫阳性神经元个数各组比较：SAMR1组、石杉碱甲组、低剂量组和中剂量组与SAMP8模型组比较,有非常显著性意义(P<0.01),绞股蓝正丁醇高剂量组与SAMP8模型组比较,有显著性差异(P<0.05)。③绞股蓝正丁醇部位对p75NTR、pJNKmRNA表达的影响：对于p75NTRmRNA, SAMR1组、石杉碱甲组与SAMP8模型组相比有非常显著性差异(P<0.01),中剂量组和低剂量与SAMP8模型组相比有显著性差异(P<0.05),对于pJNKmRNA, SAMR1组、石杉碱甲组和低剂量与SAMP8模型组相比有非常显著性差异(P<0.01)。④用、Western Blot法测定P53的表达：SAMR1组、石杉碱甲组、低剂量和中剂量组与SAMP8模型组相比有非常显著性差异(P<0.01),高剂量组与SAMP8模型组相比有显著性差异(P<0.05)。4.急性毒性试验(MTD):结果表明,给药后14天内小鼠活动,外观、行为、摄食、大小便、呼吸等未见异常,未见毒性反应及死亡发生。给药后小鼠生长发育正常,体重增长正常。绞股蓝正丁醇部位对小鼠经口的MTD为120g药材/kg,相当于成人(60kg体重)日用量(30g药材)的240倍。限于药物浓度及动物的给药容量,无法测定LD50。绞股蓝正丁醇部位毒性反应剂量大于120g(原生药)/kg(体重)。结论：1.绞股蓝正丁醇部位在体外对NG-108细胞有较好的增殖作用；对由Aβ25-35片段引起NG-108细胞的损害也有较好的保护作用,Hoechst33258染色及流式细胞法研究显示对Aβ25-35损伤的NG-108细胞凋亡有较好的抑制的作用。其保护机制可能是抑制半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的水平有关。2.绞股蓝正丁醇部位有较好的抗老年性痴呆的作用,其作用的机制可能与改善小鼠的学习、记忆能力；提高小鼠的抗氧化能力；抑制APP、BACE-1蛋白水平,使Aβ生成减少；也有可能与减少Aβ与p75NTR结合,抑制JNK通路,使pJNK含量减少,抑制了p53蛋白,增强下游的Bcl-2/Bax的表达,减少细胞色素C的释放,使半胱天冬蛋白酶-3(caspase-3)的释放减少有关。3.急性毒性试验,绞股蓝正丁醇部位对小鼠经口的MTD为120g药材/kg,相当于成人日用量的240倍,表明毒性低。

全文目录

中文摘要  3-8
ABSTRACT  8-14
目录  14-16
引言  16-19
第一部分综述  19-27
  第一节绞股蓝的化学成分及抗老年性痴呆(AD)的研究进展  19-22
    1 绞股蓝化学成分  19-20
    2 绞股蓝抗老年性痴呆(抗AD)的作用  20-21
    3 结语  21-22
  第二节抗老年性痴呆(AD)实验方法学的研究进展  22-27
    1 常用AD模型  22-23
    2 检测指标  23-25
    3 检测方法  25-26
    4 结语  26-27
第二部分体外筛选实验  27-47
  实验研究1 绞股蓝提取物体外对NG-108细胞模型的影响  27-33
    1 实验材料  27
    2 实验方法  27-28
    3 结果  28-31
    4 讨论  31-33
  实验研究2 绞股蓝正丁醇提取部位对体外A B_(25-35)造成NG-108细胞损伤及作用机制研究  33-47
    1 实验材料  33-34
    2 实验方法  34-35
    3 结果  35-44
    4 讨论  44-47
第三部分体内实验  47-91
  实验研究1 绞股蓝正丁醇部位对老年性痴呆小鼠记忆行为学的影响  47-53
    1 实验材料  47
    2 实验方法  47-48
    3 结果  48-49
    4 讨论  49-53
  实验研究2 绞股蓝正丁醇部位对老年性痴呆小鼠体内自由基代谢的影响  53-57
    1 实验材料  53
    2 实验方法  53-54
    3 结果  54-55
    4 讨论  55-57
  实验研究3 绞股蓝正丁醇部位对老年痴呆小鼠AB、APP和BACE-1的影响  57-68
    1 实验材料  57
    2 实验方法  57-60
    3 结果  60-66
    4 讨论  66-68
  实验研究4 绞股蓝正丁醇部位对老年性痴呆小鼠A B介导P75NTR凋亡通路的影响  68-89
    1 实验材料  68
    2 实验方法  68-72
    3 结果  72-83
    4 讨论  83-89
  实验研究5 绞股蓝正丁醇部位急性毒性试验  89-91
    1 实验材料  89
    2 实验方法和结果  89-90
    3 结论  90-91
结语  91-94
  1 已达到的目标  91-93
  2 本研究创新点  93
  3 本研究的不足之处及以后的研究方向  93-94
参考文献  94-102
附录  102-103
在校期间发表论文情况  103-104
致谢  104-105
统计学证明  105

绞股蓝有效部位对SAMP8小鼠抗老年性痴呆作用及其机制研究

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