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鸭瘟病毒UL21基因的克隆表达与转录时相分析

作　者: 石勇
导　师: 汪铭书
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭瘟病毒 UL21基因原核表达抗体制备转录时相
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本研究主要对鸭瘟病毒(DPV)CHv株UL21基因(Genbank登录号：EU195090)进行了生物信息学分析、全基因的克隆表达、蛋白纯化、多克隆抗体制备、实时荧光定量反转录PCR法分析基因转录时相,主要成果如下1鸭瘟病毒UL21基因生物信息学分析鸭瘟病毒UL21基因全长1686bp,预测编码561个氨基酸大小的蛋白,理论分子量约62KD,等电点pI5.49。此蛋白含有27个潜在磷酸化位点、3个潜在糖基化位点,不含有跨膜区域和信号肽。蛋白亚细胞定位预测表明该蛋白65.2%分布在细胞质,17.4%分布在细胞核。氨基酸进化树分析表明鸭瘟病毒UL21基因编码蛋白与马立克病毒属病毒亲缘关系较近。DPV UL21基因在240-255序列区域含有一个保守的结构域。密码子偏嗜性分析揭示该基因偏嗜第三位以A或T为结尾的密码子,最适合在酵母表达系统中进行表达。2鸭瘟病毒UL21基因克隆、原核表达和多克隆抗体的制备根据DPV的UL21基因序列,运用primer5在基因上下游设计了一对引物对全基因进行扩增,扩增基因片段大小1735bp(包含整个UL21基因ORF),扩增产物送大连宝生物公司进行T克隆,成功构建了PGEMT/UL21T克隆重组质粒,而后通过亚克隆构建了pET32c(+)/UL21重组表达质粒,转化B21表达菌进行原核表达。通过优化温度、IPTG浓度和表达时间,确定了UL21重组蛋白最佳表达条件：30℃,IPTG终浓度0.4mmol/L,诱导表达8小时。重组蛋白主要以包涵体形式表达存在,通过SDS-PAGE切胶回收目的蛋白,免疫兔子制备多克隆抗体,琼脂扩散试验发现最高免疫抗血清效价达到1：16,兔抗DPVUL21重组蛋白多克隆抗体制备成功。3鸭瘟病毒UL21基因转录时相分析运用SYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR法分析UL21基因在感染DPV的鸭胚成纤维细胞中不同时间点转录情况,结果表明该基因在36h开始有明显的转录,72小时达到转录高峰,而后转录水平开始下降。向接毒后的细胞培养液中加入工作浓度的更昔洛韦,发现UL21基因转录受到明显的抑制,证明DPVUL21是一个晚期基因。

全文目录

中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-5
英文缩写词汇及其含义说明  5-9
第一部分文献综述  9-14
  第一章疱疹病毒UL21基因及其编码蛋白研究进展  9-14
    1 疱疹病毒UL21基因特点  9-10
      1.1 基因序列的特点  9
      1.2 UL21基因的性质  9-10
    2 疱疹病毒UL21基因编码蛋白pUL21的特点  10-13
      2.1 UL21编码蛋白pUL21的结构特点  10
      2.2 UL21编码蛋白pUL21的定位  10-11
      2.3 UL21蛋白的功能  11-13
    3 展望  13
    4 选题的目的和意义  13-14
第二部分试验研究  14-40
  第二章鸭瘟病毒UL21基因生物信息学分析  14-23
    1. 试验材料  14-15
    2. 试验方法  15
    3. 试验结果  15-21
      3.1 DPV UL21基因编码氨基酸序列  15
      3.2 DPV UL21蛋白组分分析  15-16
      3.3 信号肽位点预测  16
      3.4 磷酸化位点预测  16
      3.5 N-糖基化位点预测  16-17
      3.6 跨膜区分析  17
      3.7 疏水性分析  17
      3.8 抗原表位分析  17-18
      3.9 蛋白质二级结构预测  18
      3.10 细胞亚定位分析  18
      3.11 氨基酸序列比对  18
      3.12 进化树分析  18-19
      3.13 密码子偏嗜性分析  19-21
      3.14 稀有密码子分析结果  21
      3.15 UL21氨基酸序列的保守结构域预测  21
    4 讨论  21-23
      4.1 鸭瘟病毒UL21基因及其编码蛋白特征  21-22
      4.2 DPV UL21基因密码子偏嗜性分析  22-23
  第三章鸭瘟病毒UL21基因克隆、原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体制备  23-34
    1. 试验材料  23-25
      1.1 质粒、菌株、毒株、抗体  23
      1.2 试验动物  23
      1.3 主要试剂  23
      1.4 主要试剂配制  23-25
      1.5 主要试验仪器  25
    2. 试验方法  25-30
      2.1 DPV基因组DNA的提取  25-26
      2.2 DPV UL21基因引物设计与扩增  26
      2.3 重组原核表达质粒pET32c/UL21的构建  26-28
      2.4 重组原核表达质粒pET32c/UL21的表达  28
      2.5 Western-blot法鉴定重组蛋白  28-29
      2.6 重组UL21蛋白表达条件的优化  29
      2.7 重组UL21蛋白的纯化  29
      2.8 兔抗重组UL21蛋白多克隆抗体的制备  29-30
      2.9 饱和硫酸铵盐析法粗提兔抗DPV UL21蛋白1gG  30
    3. 试验结果  30-33
      3.1 DPV UL21基因的PCR扩增、T克隆及亚克隆的构建  30-31
      3.2 重组蛋白的诱导表达的鉴定  31
      3.3 重组蛋白的诱导表达条件的优化  31
      3.4 Western blot法检测重组蛋白  31-32
      3.5 重组UL21蛋白的纯化  32
      3.6 兔抗DPV UL21抗体效价检测与抗体IgG的粗提  32-33
    4 分析和讨论  33-34
      4.1 引物设计  33
      4.2 重组蛋白表达条件的优化  33
      4.3 重组蛋白的纯化  33-34
  第四章鸭瘟病毒UL21基因转录时相分析  34-40
    1. 试验材料  34
      1.1 试验动物、毒株  34
      1.2 主要试验试剂  34
      1.3 主要试验仪器  34
    2. FQ-PCR法分析感染DPV的DEF中UL21基因转录时相  34-36
      2.1 FQ-PCR引物的设计与合成  34
      2.2 标准曲线的绘制  34-35
      2.3 鸭胚成纤维细胞的培养与病毒接种  35
      2.4 Total RNA的抽提  35
      2.5 RNA完整性检测及去除其中的DNA  35
      2.6 反转录反应  35-36
      2.7 DPV UL21基因转录时相分析  36
      2.8 DPV UL21基因类型的确定  36
    3 试验结果  36-38
      3.1 DPV UL21和β-actin基因标准曲线的建立  36-37
      3.2 Total RNA完整度与纯度检测  37
      3.3 DPV UL21基因转录时相分析  37-38
      3.4 UL21基因类型的鉴定  38
    4 讨论  38-40
参考文献  40-45
致谢  45
攻读学位期间发表的学术论文目录  45

鸭瘟病毒UL21基因的克隆表达与转录时相分析

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